ChineseJournalofCellBiology2013,35
(6):816–823 DOI:10.11844/cjcb.2013.06.0042 p38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞 成骨分化中的作用 陈学鹏1*施洁珺1叶青松2蔡霞3张天厚4* (1浙江大学医学院附属口腔医院正畸科,杭州310006;2詹姆斯库克大学牙学院正畸科,凯恩斯4870,澳大利亚;3浙江大学医学院附属口腔医院牙周科,杭州310006;4浙江大学医学院附属第二医院口腔科,杭州310009) 摘要该文主要探讨p38MAPK信号通路在人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用。
从人成骨肉瘤细胞株MG-63中克隆hBMP-2基因,通过基因重组技术构建pcDNA3.1(+)-hBMP-2真核表达质粒,采用脂质体法转染人牙囊细胞,以G418筛选得到能够稳定表达BMP-2的细胞克隆。
QuantitativeReal-timeRT-PCR及Westernblot检测BMP-2目的基因和蛋白的表达。
以p38MAPK特异性抑制剂SB203580作用于稳定表达BMP-2的人牙囊细胞,观察MAPKAP激酶-2磷酸化蛋白、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因表达水平变化。
结果显示,通过基因重组和基因转染获得能够稳定表达BMP-2的人牙囊细胞。
SB203580明显降低MAPKAP激酶-2磷酸化蛋白的表达水平。
BMP-2水平持续高表达能诱导人牙囊细胞碱性磷酸酶活性升高,同时增强OSX、Runx2、OCN、BSP及OPN等成骨相关基因的表达水平,但BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化的作用被SB203580抑制。
这表明,p38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中发挥调控作用。
关键词牙囊细胞;骨形态发生蛋白-2;成骨分化;p38MAPK信号通路 Effectofp38MAPKSignalingPathwayonBMP-2-inducedOsteogenicDifferentiationofHumanDentalFollicleCells ChenXuepeng1*,ShiJiejun1,YeQingsong2,CaiXia3,ZhangTianhou4* (1DepartmentofOrthodontics,StomatologicalHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofZhejiangUniversity,Hangzhou310006,China;2DepartmentofOrthodontics,SchoolofMedicineandDentistry,JamesCookUniversity,Cairns4870,Australia; 3DepartmentofPeriodontology,StomatologicalHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofZhejiangUniversity,Hangzhou310006,China;4DepartmentofStomatology,SecondAffiliatedHospitaltoMedicalCollegeofZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China) AbstractTheaimofthispaperistostudywhetherp38MAPKsignalingpathwayisinvolvedinBMP-2inducedosteogenicdifferentiationofhumandentalfolliclecells(HDFC).hBMP-2genewasclonedfromhumanacelllineMG-63.TheeukaryoticplasmidpcDNA3.1(+)-hBMP-2wasconstructedbybinantDNAtechnologyandtransducedintoHDFCbyliposome-mediatedcellulardelivery.AfterselectionwithG418,theresistantcloneswhichcanstablyoverexpresstheexogenousBMP-2wereobtained.TheexpressionlevelsofBMP-
2 收稿日期:2013-02-12　　　接受日期:2013-03-25国家自然科学基金(批准号:81100752)、浙江省自然科学基金(批准号:LQ12H14001)、浙江省医药卫生一般研究计划(批准号:2012KYA126)和浙江省中医药科学研究基金计划(批准号:2012ZB101)资助的课题*通讯作者。
Tel:0571-87217222,E-mail:cxp1979@;Tel:0571-86458528,E-mail:fancyee@Received:February12,2013　　　epted:March25,2013ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(GrantNo.81100752),theNaturalScienceFoundationofZhejiangProvince(GrantNo.LQ12H14001),theScientificResearchFundofZhejiangProvincialHealthDepartment(GrantNo.2012KYA126)andTraditionalChineseMedicineScienceResearchFundofZhejiangProvince(GrantNo.2012ZB101)*Correspondingauthor.Tel:+86-571-87217222,E-mail:cxp1979@;Tel:+86-571-86458528,E-mail:fancyee@网络出版时间:2013-05-2309:32　　　URL: 陈学鹏等:P38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用 817 mRNAandproteinweredeterminedbyquantitativereal-timeRT-PCRandWesternblotrespectively.Theeffectof p38MAPKspecificinhibitorSB203580ontheexpressionofphospho-MAPKAPkinase-2proteinwasexamined. Finally,theeffectofSB203580onBMP-2-inducedALPactivityandexpressionofosteogenesis-relatedgeneswere investigated.TheresultsshowedthatHDFCwhichcanstablyoverexpresstheexogenousBMP-2wereobtainedby genebinationandtransfection.SB203580couldsignificantlydecreasetheproteinlevelofphospho-MAP- KAPKinase-
2.OverexpressionofBMP-2couldincreaseALPactivityandenhancetheexpressionofosteogenesis- relatedgenessuchasOSX,Runx2,OCN,BSPandOPN.However,theeffectofBMP-2-inducedosteogenicdif- ferentiationwasinhibitedbySB203580.Thesefindingssuggestthatp38MAPKsignalingpathwayisinvolvedin BMP-2-inducedosteogenicdifferentiationofHDFC. Keywords dentalfolliclecell;boneicprotein-2;osteogenicdifferentiation;p38MAPK signalingpathway 牙囊细胞是一种具有多向分化潜能的细胞,能在一定的时间和阶段向牙周膜成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞分化,是目前在牙周组织工程研究中受到广泛关注的候选种子细胞之一[1]。
但牙囊细胞多向分化的机理目前尚不完全清楚。
骨形态发生蛋白-2(boneicprotein-
2,BMP-2)是已知的所有生长因子中骨形成作用最强的一种,具有诱导未分化的间充质干细胞向成骨细胞定向分化与增殖的能力[2-3]。
目前研究证实,BMP-2能促进牙囊细胞向成骨细胞/成牙骨质细胞分化[4]。
p38MAPK为丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)的一重要亚型,并被证实与体内成骨细胞的分化有关[5]。
然而,p38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用尚未见报道,本实验将对这一问题进行研究。
1材料与方法 1.1材料1.1.1细胞与质粒人成骨肉瘤细胞株MG-63(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);pcDNA3.1(+)载体(美国Invitrogen公司);pGEM-T载体(美国Promega公司);pLEGFP-C1载体(美国Clontech公司)。
1.1.2主要试剂和仪器DMEM培养液(美国Hyclone公司);胎牛血清及胰蛋白酶(美国Gibco公司);LipofectamineTM2000试剂盒、T4DNA连接酶及Trizol(美国Invitrogen公司);质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及DNA凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司);限制性内切酶及PremixTaq(SYBR)(日本TaKaRa公司);小鼠抗人BMP-2单克隆抗体、辣 根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(美国Sigma公司);兔抗人磷酸化MAPKAP激酶-2(MAPKAPkinase-2;MK-2)单克隆抗体、兔抗人osterix(OSX)多克隆抗体、小鼠抗人Runx2单克隆抗体、兔抗人骨钙素(osteocalcin,OCN)单克隆抗体、小鼠抗人骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)单克隆抗体、小鼠抗人骨桥蛋白(osteopontin,OPN)单克隆抗体及小鼠抗人β-actin单克隆抗体(英国Abcam公司);SB203580(美国Calbiochem公司);逆转录试剂盒(美国Promega公司);PCR试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司);BCA蛋白检测试剂盒(美国Pierce公司);EnzoLyte™pNPP碱性磷酸酶试剂盒(美国AnaSpec公司);CO2细胞培养箱(美国FormaScientific公司);YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂);倒置相差显微镜及照像系统(日本Olympus公司);凝胶成像分析仪(英国Ultra-VioletProductsLtd);核酸蛋白定量分析仪及Mastercycler梯度PCR仪(德国Eppendorf公司);PCR仪(美国MJResearch公司);APIPRISM7300Real-timePCR仪(美国AppliedBiosystems公司);酶标仪(美国Bio-Tek公司)。
1.2质粒构建1.2.1PCR扩增BMP-2基因序列用Trizol从人成骨肉瘤细胞株MG-63中提取总RNA,紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。
逆转录反应按照逆转录试剂盒说明书操作,合成cDNA第一链,然后以其为模板进行PCR反应。
人BMP-2的引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。
BMP-2上游引物:5′-CCGGAATTCATGGTGGCCGGGACCCGCTGTCTTCT-3′,下游引物:5′-TTTAGCGGCCGCCTAGCGACACCCACAACCCTCCA-3′。
在 818 PCR管中加入20μL反应体系,包括Premix-Taq10μL、cDNA模板1μ
L、上下游引物各0.5μ
L、灭菌蒸馏水8μ
L。
反应条件:94°C预变性5min,1个循环;94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸45s,30个循环;最后72°C延伸10min,冷却至4°
C。
将PCR扩增产物以l%琼脂糖凝胶进行电泳,紫外灯下观察电泳结果并照相。
1.2.2PCR产物的纯化回收PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳分离,按DNA凝胶回收试剂盒说明书操作回收约1.2Kb的目的片段。
回收后按DNA纯化试剂盒说明书进行,纯化目的基因。
1.2.3重组质粒pGEM-T-hBMP-2的构建将回收纯化的PCR产物和pGEM-T载体片段等摩尔数混合,加入T4DNA连接酶于16°C下连接反应,过夜,然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
将转化菌于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上37°C孵育16h,挑选20个白色单菌落扩大培养。
采用质粒小提试剂盒提取质粒,经EcoRI和NotI双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,筛选阳性克隆。
以阳性克隆DNA为模板进行PCR反应(引物同1.2.1中RT-PCR反应引物),PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳进一步验证重组质粒是否含有目的cDNA片段。
将阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司作DNA测序。
1.2.4真核表达载体pcDNA3.1(+)-hBMP-2的构建和测序将经测序鉴定正确的pGEM-T-BMP-2质粒和pcDNA3.1(+)真核表达载体分别用EcoRI和NotI双酶切,回收纯化目的基因片段BMP-2和线性化的pcDNA3.1(+)。
用T4DNA连接酶将二者连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
分别按照菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定来筛选阳性克隆。
1.3人牙囊细胞的培养及基因转染 人牙囊组织的取材及本实验研究方案经浙江大学医学院附属口腔医院伦理委员会批准。
人牙囊细胞的原代培养参照我们以前报道的方法进行[6]。
待原代培养的牙囊细胞生长至80%丰度时,用0.25%胰酶消化,1:2传代,通过差速传代法提纯牙囊细胞,大约传代2次即可纯化细胞。
取生长状态良好的第4代人牙囊细胞用于基因转染。
转染前一天,将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后,将细胞浓度调整为3×105/mL,接种于6孔板,每孔2mL。
待细胞融合铺满板底80%左右时进行转染,转染按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。
转染后的细胞 ·研究论文· 采用400μg/mLG418进行筛选,阳性克隆形成后继续扩增培养4周。
以转染pLEGFP-C1空载体的牙囊细胞作为阳性对照。
将转染BMP-2及GFP基因的牙囊细胞分别命名为HDFC-BMP2和HDFC-GFP,未转染的牙囊细胞命名为HDFC-
C。
1.4BMP-2目的基因和蛋白的检测 取生长状态良好的HDFC-BMP2、HDFC-GFP及HDFC-C细胞,接种到75cm2培养瓶中,当细胞生长至80%丰度时,每个培养瓶换成12mL无血清的DMEM培养液,继续孵育24h后,采用quantitativereal-timeRT-PCR(qRT-PCR)和Westernblot分别检测三组细胞BMP-2基因和蛋白的表达。
qRT-PCR参照我们以前报道的方法[7]进行。
简言之,提取细胞总RNA后,按照逆转录试剂盒说明书操作进行逆转录,完成cDNA第一链的合成。
BMP-2及β-actin的引物序列见表
1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将引物浓度调整到20μmol/L,采用温度梯度PCR,确定最适退火温度为58°
C。
上APIPRISM7300real-timePCR仪,以β-actin为内参照(管家基因),每个体系作3个复孔。
20μL反应体系包括:cDNA0.5μ
L、ROXReferenceDye(一种染料)0.4μ
L、PremixTaq(SYBR)10μ
L、上下游引物各0.4μ
L、灭菌蒸馏水8.3μ
L。
反应条件:94°C预变性10min,1个循环;94°C变性60s,58°C退火60s,72°C延伸60s,45个循环。
采用2–ΔΔCt法计算BMP-2基因的相对表达量。
Westernblot参照我们以前报道的方法[7]进行,以BMP-2/β-actin的灰度比值表示BMP-2蛋白的相对表达水平。
1.5MK-2磷酸化蛋白表达水平检测将HDFC-BMP2和HDFC-C细胞用胰酶消化后 接种到75cm2培养瓶中,当细胞生长至80%丰度时,将培养液换成12mL无血清的DMEM培养液。
2h后将培养的细胞随机分成三组,分别为HDFC-C组(每个培养瓶中加无血清的DMEM培养液12mL)、HDFC-BMP2组(每个培养瓶中加无血清的DMEM培养液12mL)和HDFC-BMP2+SB203580组(每个培养瓶中加含50μmol/LSB203580的无血清DMEM培养液12mL)。
每组6瓶,继续孵育24h后终止培养。
采用Westernblot检测三组细胞MK-2磷酸化蛋白表达水平。
1.6碱性磷酸酶活性的检测将HDFC-BMP2和HDFC-C细胞用胰酶消化 陈学鹏等:P38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用 819 表1QuantitativeReal-timeRT-PCR引物序列 Table1Primersequencesusedforquantitative Real-timeRT-PCR 基因Gene 引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′) BMP-
2 Forward:ATGGATTCGTGGTGGAAGTGReverse:GTGGAGTTCAGATGATCAGC Forward:CCCCACCTCTTGCAACCAOSX Reverse:GGCTCCACCACTCCCTTCTAG Runx2 Forward:GCAGCACGCTATTAAATCCAAATTReverse:GGCACGAAGGCTCATCATTC OCN Forward:CCTCACACTCCTCGCCCTATTReverse:CCCTCCTGCTTGGACACAAA Forward:AAACGAAGAAAGCGAAGCAGAABSP Reverse:GCTGCCGTTGCCGTTTT Forward:GCCGACCAAGGAAAACTCACTAOPN Reverse:CAGAACTTCCAGAATCAGCCTGTT β-actin Forward:GGGTCAGAAGGATTCCTATGReverse:GGTCTCAAACATGATCTGGG 组另取5孔,取上清液按照EnzoLyte™pNPP碱性磷酸酶试剂盒要求操作,选择405nm波长测定各孔吸光度值。
碱性磷酸酶活性的计算按下面公式进行:M=D405nm(405nm吸光度值)/D560nm(560nm吸光度值),碱性磷酸酶活性变化百分比=[(实验组的M值–对照组的M值)/对照组的M值)]×100[6]。
计算时,以HDFCC0h组作为对照组。
1.7成骨相关基因(蛋白)的检测 细胞分组及预处理同1.5。
采用qRT-PCR和Westernblot分别检测3组细胞OSX、Runx2、OCN、BSP、OPN基因和蛋白的表达。
qRT-PCR引物序列见表
1。
1.8统计学方法 所有实验均重复3次,定量实验结果的所有数据均以均数±标准差表示,采用统计软件包SPSS16.0进行统计分析,各组之间差异的比较采用独立样本t检验,P<0.05有统计学意义。
后,以每孔2×103细胞接种到96孔板上,每孔加含5%FBS的DMEM培养液100μ
L。
当细胞生长至70%丰度时,将培养液换成100μL无血清的DMEM培养液。
2h后将培养的细胞随机分成三组:HDFC-C组(每孔加无血清的DMEM培养液100μL)、HDFC-BMP2组(每孔加无血清的DMEM培养液100μL)和HDFCBMP2+SB203580组(每孔加含50μmol/LSB203580的无血清DMEM培养液100μL),分别在0,24,48,72h终止培养,每组各时间点均设10个复孔。
终止培养后,每小组取5孔,收集上清液按照BCA蛋白检测试剂盒说明进行细胞蛋白质含量的测定。
选择560nm波长测定各孔吸光度值。
然后每小 2结果 2.1hBMP-2真核表达质粒的构建2.1.1RT-PCR扩增目的基因以人成骨肉瘤细胞株MG-63总RNA为模板,RT-PCR扩增,其产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在1.2Kb左右有特异性扩增条带,大小与预期相符,提示扩增产物为BMP-2基因片段(图1A)。
2.1.2重组质粒pGEM-T-hBMP-2的构建和酶切鉴定重组质粒pGEM-T-hBMP-2经EcoRI和NotI双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳可见1.2Kb的BMP-2条带和3.0Kb的载体片段,酶切BMP-2条带与RT-PCR产物电泳带处于相同位置(图1B)。
(A) bpM (B)
1 2000 KbM
1 1000 65 750
4 500
3 2 250 100
1 (C) bpM
1 2
3 22000 1000750500 250100 A:RT-PCR产物电泳,M:DL2000marker;1:RT-PCR产物;B:重组质粒酶切电泳,M:1KbDNAmarker;1:pGEM-T-hBMP-2经EcoRI+NotI双酶切;2:pcDNA3.1(+)-hBMP-2经EcoRI+NotI双酶切;C:重组菌落PCR,M:DL2000marker;1-3:目的基因。
A:hBMP-2clonedbyRT-PCR.M:DL2000marker;1:RT-PCRproduct;B:restrictionenzymedigestionanalysisofbinantplasmid.M:1KbDNAmarker,1:pGEM-T-hBMP-2digestedwithEcoRI+NotI,2:pcDNA3.1(+)-hBMP-2digestedwithEcoRI+NotI;C:PCRscreeningofbinantDNAfrombacterialcolonies;M:DL2000marker;1-3:targetgene. 图1人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的构建及鉴定Fig.1Constructionandidentificationofhumanboneicprotein-2(hBMP-2)eukaryoticplasmid 820 ·研究论文· (A) (B)BMP-
2 RelativemRNAexpressionRatioofD # 4.0 # 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0HDFC-CHDFC-GFPHDFC-BMP2 β-actinHDFC-C 1.61.41.21.00.80.60.40.2 0HDFC-
C HDFC-GFPHDFC-BMP2** HDFC-GFPHDFC-BMP2 A:实时定量RT-PCR检测各处理组人牙囊细胞BMP-2转录水平,β-actin为内参,#P<0.01;B:Westernblot检测各处理组人牙囊细胞BMP-2蛋白表达水平,β-actin为内参,*P<0.05。
A:qRT-PCRanalysisofBMP-2transcriptlevelsindifferentHDFCgroups,usingβ-actinasaninternalcontrol.#P<0.01;B:WesternblotanalysisofBMP-2proteinlevelsindifferentHDFCgroups,usingβ-actinasaninternalcontrol.*P<0.05. 图2各处理组人牙囊细胞BMP-2的表达Fig.2ExpressionofBMP-2indifferentHDFCgroups RatioofDALPactivity(%ofcontrol) 2.1.3真核表达载体pcDNA3.1(+)-hBMP-2的构建和酶切鉴定菌落PCR结果可见1.2Kb的BMP-2条带(图1C)。
重组质粒pcDNA3.1(+)-hBMP-2经EcoRI和NotI双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳可见1.2Kb的 (A)p-MK-
2 β-actin HDFC-CSB203580_ HDFC-BMP2HDFC-BMP2 _ + (B)0.8 # * # 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 HDFC-
C HDFC-BMP2 HDFC-BMP2+SB203580 A:Westernblot代表性电泳条带;B:各处理组人牙囊细胞MK-2磷酸化蛋白相对表达量,以β-actin作为内参。
*P<0.05,#P<0.01。
A:representativeWesternblotelectrophoresisgraph;B:relativedensitometricanalysisofphospho-MAPKAPkinase-2(p-MK-2)proteinindifferentHDFCgroups,usingβ-actinasaninternalcontrol.*P<0.05,#P<0.01. 图3Westernblot检测各处理组人牙囊细胞MK-2磷酸化蛋白表达水平 Fig.3Westernblotanalysisofphospho-MAPKAPkinase-2(p-MK-2)proteinlevelsindifferentHDFCgroups BMP-2条带和5.0Kb的载体片段,酶切BMP-2条带与RT-PCR产物电泳带处于相同位置(图1B),重组质粒酶谱分析与预期一致。
2.2BMP-2目的基因和蛋白的检测如图2所示,HDFC-BMP2组BMP-2mRNA及蛋 白的表达水平均明显高于HDFC-GFP及HDFC-C组,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3MK-2磷酸化蛋白表达水平检测 如图3所示,HDFC-BMP2组MK-2磷酸化蛋白表达水平明显高于HDFC-C组,差异有统计学意义(P<0.05)。
HDFC-BMP2+SB203580组MK-2磷酸化 300HDFC-CHDFC-BMP2 HDFC-BMP2+SB203580 ## 250 ## 200 ## 150 100 50
0 0 24 48 72 #P<0.01. Treatment
time(h) 图4各处理组人牙囊细胞碱性磷酸酶活性的比较 Fig.4ComparisonofALPactivityindifferentHDFCgroups 陈学鹏等:P38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用 821
6 # (A) # #
5 HDFC-
C HDFC-BMP2 HDFC-BMP2+SB203580 Relative
mRNAexpressionRatioofD
4 #* # # # # 3#*
2 1
0 OSX (B) Runx2 OSXRunx2OCNBSP OPNβ-actin SB203580 HDF_C-
C HDFC_-BMP2 HDFC-BMP2+ OCN BSP 1.8 HDFC-
C 1.6HDFC-BMP2 1.41.2#*
1 * 0.8#* 0.6 0.4 0.2 0OSXRunx2 OPN HDFC-BMP2+SB203580** *#** OCN BSP OPN A:实时定量RT-PCR检测各处理组人牙囊细胞成骨相关基因转录水平,β-actin为内参。
*P<0.05,#P<0.01;B:Westernblot检测各处理组人牙囊细胞成骨相关基因的蛋白表达水平,β-actin为内参。
*P<0.05,#P<0.01。
A:qRT-PCRanalysisofthetranscriptlevelsofdifferentosteogenesis-relatedgenesindifferentHDFCgroups,usingβ-actinasaninternalcontrol.*P<0.05,#P<0.01;B:Westernblotanalysisoftheproteinlevelsofdifferentosteogenesis-relatedgenesindifferentHDFCgroups,usingβ-actinasaninternalcontrol.*P<0.05,#P<0.01. 图5各处理组人牙囊细胞成骨相关基因的表达 Fig.5Expressionofosteogenesis-relatedgenesindifferentHDFCgroups 蛋白表达水平明显低于HDFC-C组及HDFC-BMP2组,差异有统计学意义(P<0.01)。
2.4碱性磷酸酶活性的检测 如图4所示,随时间延长,各处理组牙囊细胞碱性磷酸酶活性均升高,但在24~72h,HDFC-BMP2组碱性磷酸酶活性明显高于相应的对照组(HDFC-C组及HDFC-BMP2+SB203580组)(P<0.01)。
2.5成骨相关基因(蛋白)的检测 如图5所示,HDFC-BMP2组OSX、Runx2、OCN、BSP及OPN基因和蛋白的表达水平均明显高于HDFC-C组及HDFC-BMP2+SB203580组,差异有统计学意义(P<0.05)。
HDFC-BMP2+SB203580组OSX基因和蛋白的表达水平均高于HDFC-C组,差异有统计学意义(P<0.05)。
3讨论 骨形态发生蛋白(boneicproteins,BMPs)是一种多功能的生长因子,能诱导成骨细胞和软骨细胞的分化成熟,并能在体内诱导异位成骨,是目前牙周组织工程研究的热点。
其中,BMP-2是最主要的骨形成调控因子。
在骨组织形成的过程 中,BMP-2与骨形成蛋白受体BMPR结合,通过细胞内信号转导,活化下游转录因子,使转录因子与相应的成骨细胞特异蛋白碱性磷酸酶、OCN、OPN等基因启动子连接,促进细胞向成骨方向分化。
研究表明,将rhBMP-2作用于永生化的小鼠牙囊细胞后,Runx2、OCN、BSP等基因表达增强,诱导牙囊细胞向成骨细胞/成牙骨质细胞表型分化[4]。
但BMP-2诱导牙囊细胞成骨分化的机理尚不完全清楚。
MAPK 822 信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统,参与了细胞的增殖、分化、凋亡等多种生理过程[8]。
而在干细胞向成骨细胞表型分化过程中,p38MAPK亚型起着重要的调控作用。
研究表明,BMP-2可通过p38MAPK信号通路,促进骨特异性转录因子Runx2的表达[9]。
牙囊细胞是一种具有多向分化潜能的细胞,具有干细胞的某些特性。
最近的文献证实,BMP-9可通过p38MAPK信号通路促进牙囊细胞向成骨细胞表型分化[10]。
我们推测p38MAPK信号通路可能在BMP-2诱导牙囊细胞成骨分化过程中也发挥作用。
为了证实这一推测,本研究首先通过基因工程技术克隆并构建了pcDNA3.1(+)-hBMP-2真核表达载体,并通过基因转染将外源性BMP-2基因导入人牙囊细胞中。
通过对BMP-2目的基因(蛋白)的检测证实,转染pcDNA3.1(+)-hBMP-2真核表达载体的人牙囊细胞能够在一定时期内稳定高表达BMP-2基因(蛋白)。
在此基础上,将p38MAPK信号抑制剂作用于转染BMP-2基因的人牙囊细胞以抑制p38MAPK信号通路。
SB203580是目前使用最为广泛的p38MAPK信号抑制剂,它并不是通过抑制p38上游激酶的活性来发挥作用,而是通过直接占据p38ATP结合位点,从而抑制下游底物MK-2的磷酸化及其功能发挥[11]。
本实验采用SB203580抑制p38MAPK信号通路,Westernblot结果显示,使用SB203580后MK-2磷酸化蛋白降至极低水平,表明p38MAPK信号通路被有效抑制。
OSX、Runx2是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的两种骨特异性转录因子,与骨形成密切相关[12]。
本研究表明,转染BMP-2基因的人牙囊细胞OSX、Runx2基因和蛋白表达水平均较对照组明显增强,但使用SB203580后,BMP-2诱导的人牙囊细胞OSX、Runx2基因和蛋白表达水平较不使用SB203580的HDFC-BMP2组明显降低,说明p38MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞OSX、Runx2表达中发挥作用。
但研究结果还发现,HDFCBMP2+SB203580组OSX、Runx2基因和蛋白的表达水平均高于对照组,尤其是OSX基因和蛋白的表达水平与对照组有显著性差异。
由于本实验最后使用的是无血清的培养液,基本排除了其他细胞因子对实验结果的干扰。
这表明可能还有其他信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞OSX、Runx2表达中发挥 ·研究论文· 作用。
研究表明,BMP-2能通过smad信号通路调控OSX、Runx2表达[9,13],这表明在BMP-2诱导人牙囊细胞OSX、Runx2表达中有多条信号转导机制在发挥作用。
碱性磷酸酶、OCN、BSP、OPN是研究成骨细胞等具有矿化功能的细胞分化的重要指标。
本 实验采用SB203580抑制p38MAPK信号通路,观察BMP-2诱导人牙囊细胞碱性磷酸酶活性及OCN、BSP、OPN基因和蛋白表达水平的变化。
结果表明,BMP-2能诱导人牙囊细胞碱性磷酸酶活性升高,增强OCN、BSP、OPN基因和蛋白的表达水平,但SB203580能抑制BMP-2的这种诱导作用。
结合SB203580抑制BMP-2诱导OSX、Runx2表达这一结果,本研究表明,在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化过程中,p38MAPK信号通路是参与细胞内信号转导的途径之
一。
目前,研究证实牙囊细胞中含有三种异质性细胞亚群,其形态、增殖能力和矿化特征均不相同[14-15]。
我们还不清楚究竟是所有的牙囊细胞 亚群在BMP-2作用下都能向成骨细胞的表型分化,还是只有部分特定的细胞亚群(将分化成为成骨细胞或成牙骨质细胞的牙囊细胞)有这种能力,这些尚有待于我们做进一步的研究。
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