人源样本直接PCR试剂盒
产品货号：F-150，200rxnsx20μl
-20°C保存，有效期为1年。
稀释缓冲液一旦解冻可放于4°C保存。
1.简介 ThermoScientificPhusion®人源样本直接PCR试剂盒可直接以各种人源样本为模板进行PCR，而无需DNA的纯化。
如口腔拭子、唾液、指甲、牙齿、毛发，羊水和皮肤活体组织都可以作为实验的起始材料。
该试剂盒适用于新鲜、冷冻，甚至是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人源组织样本。
注意：本产品仅适用于实验室研究。
Phusion人源样本直接PCR试剂盒提供改良的Phusion®热启动II高保真DNA聚合酶。
该酶是一种特殊的工程酶，融合有DNA双链结合蛋白，不但聚合能力强，而且对许多人源样本中的PCR抑制剂表现出超强的抵抗力。
Phusion人源样本直接PCR试剂盒包含了适用于直接法和稀释法两种实验方案的所有试剂。
针对不同的实验材料提供不同的操作指南（详见第4节的操作流程选择）。
当使用新的引物对或者样品材料时，推荐首先使用稀释法方案。
该试剂盒提供对照引物，可用以扩增来自人源样本的237bp片段。
该试剂盒通常用于终点PCR。
重要提示 变性温度为98°
C。
退火温度与众多常规DNA聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）不同，具体请参照6.3。
延伸时，若扩增子片段≤1kb，则延伸时间设定 为15s即可；若扩增子片段>1kb，则按15s/kb设定延伸时间。
将样品直接加入PCR反应液中而不是空白管中。
PhusionDNA聚合酶产生的是平末端DNA产物。
2.包装信息 组分 Phusion®人源样本DNA聚合酶2xPhusion®人源样本PCR缓冲液(包含dNTPsandMgCl2)通用对照引物（每种25μM）稀释缓冲液DNAReleaseTM添加剂 材料安全数据表见 80μl2x1ml 40μl2x5ml3x100μl
3.PCR操作指南 使用前请对各管小心混匀并离心，以保证均质，提高产物得率。
PCR体系的建立可在室温下完成。
注意：请于最后将样品加到反应体系中。
请参照第４节的样品处理指南。
Page1 表
1.加样指南 组份 20μl反应 体系 H2O 定容至20μl 2xPhusion®人源样本PCR缓冲液 10μl 引物A引物BPhusion®人源样本DNA聚合酶 xμlxμl 0.4μl 样本量（详见第4部分） 直接法： 加入量随样本而异 50μl反应体系 定容至50μl25μlxμlxμl1μl 加入量随样本而异 终浓度 1x0.5μM0.5μ
M 稀释法： 0.5μl 1.25μl 表
2.循环扩增程序推荐 循环 两步法 三步法 步骤温度 时间温度 时间 起始 98℃ 5min98℃ 5min 变性 变性 98℃ 1s98℃ 1s 退火（详- -X℃ 5s 见6.3） 延伸（详72℃15s≤1kb72℃15s≤1kb 见6.4） 15s/kb> 15s/kb> 1kb 1kb 最后 72℃ 1min72℃ 1min 延伸 4℃ 保持4℃ 保持 循环数1 35-40
1 4.样品处理指南 4.1样品类型及相应的操作方法 该试剂盒已经过优化，适用于多种人源样本。
请参考4.2人源样本列表。
每一种样本材料都有其专门的实验方案。
4.2固体样本 4.2.1口腔拭子（如，尼龙绒拭子） a）直接法：使用HarrisTMUni-Core取样工具（可单独提供），打出一个直径约0.5mm的圆孔样品，然后将其直接放入20μlPCR反应液中。
在某些实验中，将反应体积增加到50μl或者将样品直径减少到0.35mm有利于获得更好的实验结果。
b）稀释法：将口腔拭子的末端插入含有50μl稀释缓冲液，1.5μlDNAReleaseTM添加剂和250μlTE（pH8.0）的1.5ml离心管中，旋转5-10次，然后轻轻地对着管壁挤压拭子的末端，取出拭子。
涡旋振荡混匀并离心。
将离心管置于98℃温浴2分钟，再次离心，然后取0.5μl上清做模板，在20μlPCR反应体系内进行扩增。
注意：拭子的使用技巧和贮存条件（不能太干燥）可能影响产物得率。
4.2.2头发 a）直接法：取1-2mm带毛囊的头发，将其直接加入20μl的PCR反应体系中。
在某些实验中，将反应体积增加到50μl有利于获得更好的实验结果。
b）稀释法：将２-３mm带毛囊的头发放入含有20μl稀释缓冲液和0.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保头发浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
4.2.3牙齿 a）直接法：取尺寸如右黑点(·)大小的牙齿，将其直接加入20μl的PCR反应体系中。
注意：当扩增DNA片段大于1kb时，建议使用稀释法进行PCR扩增。
b）稀释法：将约13-15mg的牙齿样本放入含有50μl稀释缓冲液和1.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保牙齿浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
Page2 注意：如果样本被充分磨碎，实验效果会更好，例如提升反应的灵敏度。
可以使用研钵或者匀浆器于液氮内磨碎样本。
4.2.4皮肤活体组织（未固定） a）直接法：使用HarrisTMUni-Core取样工具（可单独提供），打出一个直径约0.5mm的圆孔样品，然后将其直接放入20μlPCR反应液中。
在某些实验中，将反应体积增加到50μl或者将样品直径减少到0.35mm有利于获得更好的实验结果。
b）稀释法：将直径2mm的皮肤小块放入含有20μl稀释缓冲液和0.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保样本浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
4.2.5指甲 a）直接法：取一小块样本（大约1x2mm，或者<1mg），将其直接放入20μl的PCR反应液中。
注意：当扩增DNA片段大于1kb时，建议使用稀释法进行PCR扩增。
b）稀释法：将约7mg的指甲样本放入含有50μl稀释缓冲液和1.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保样本浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
注意：如果样本被充分切碎，实验效果会更好，例如可以提高反应的灵敏度。
4.2.6福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织样本 a）直接法：不推荐。
b）稀释法：FFPE组织切片：将一块约7-10μm厚的FFPE人源组织样本放入 含有50μl稀释缓冲液，1.5μlDNAReleaseTM添加剂和50μlTE（pH8.0）的反应管中，*用枪头捣碎组织，并离心，确保样本浸没在溶液中。
将反应体系置于60℃孵育1h，而后在98℃孵育10分钟，冷却后离心（16000xg,2min），转移上清到一个新的离心管中。
取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系进行扩增。
在某些实验中，如果上清中的组织碎片或者DNA量非常高，建议稀释上清。
可用水或者TE对其进行1:10或者1:100的稀释。
然后取0.5μl稀释后的上清加入20μlPCR反应体系，进行扩增。
FFPE组织显微切片（未染色）：将稀释缓冲液和TE（pH8.0）缓冲液按1:1的体积比进行混合。
充分振荡后吸取100μl混合液加到4-7μm厚的FFPE组织显微切片上，用枪头将玻片上的组织刮离，并将溶液和组织一同转到干净离心管中，并加入1.5μlDNAReleaseTM添加剂。
*用枪头吹打溶液，并离心。
确保样本浸没在溶液中。
将其于60℃孵育1h，接下来在98℃孵育10min，冷却后离心（16000xg,2min），转移上清到一个新的离心管中。
取0.5μl上清加入到20μlPCR反应体系内，进行扩增。
在某些实验中，如果上清中的组织碎片或者DNA量非常高，建议稀释上清。
可用水或者TE对其进行1:10或者1:100的稀释。
然后取0.5μl稀释后的上清置于20μlPCR反应体系，充当扩增模板。
注意：通常FFPE组织中的DNA会被片段化，故能够被成功扩增的PCR产物长度有限。
我们建议扩增子最好小于300bp。
对于某些实验，如果第一步的孵育时间从1小时延长至过夜，可提高PCR产物的得率。
4.3液体样本 4.3.1唾液 a）直接法：取0.2–0.5μl唾液直接加入20μl的PCR反应体系中。
b）稀释法：取5μl唾液样本加入含有20μl稀释缓冲液和0.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中。
Page3 涡旋振荡混匀，并离心。
将其于98℃孵育2min，再次离心后取0.5μl上清加入到20μlPCR反应体系内，进行扩增。
注意：推荐使用新鲜的唾液样本。
如果需要在PCR前将唾液样本贮存一段时间，建议使用商用唾液收集管（如Oragene®.DNAfromGenotek）。
4.3.2羊水 a）直接法：取0.5–2μl羊水直接加入20μl的PCR反应体系中。
b）稀释法：不推荐。
5.各反应组分说明 5.1酶 Phusion人源样本DNA聚合酶是一种带有独特结构域的具有校正功能的聚合酶，该结构域大大增强了酶的处理能力，赋予了其强劲、快速和精准的特性。
该酶的热启动技术是基于可逆结合Affibody®蛋白的失活技术1，
2。
Phusion人源样本DNA聚合酶具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。
当使用Phusion人源样本DNA聚合酶扩增克隆片断时，我们推荐使用平末端克隆。
如果需进行TA克隆，可以使用诸如DyNAzymeTMIIDNA聚合酶（F-501）给平末端PCR产物加A尾。
但是在加A尾之前，请务必纯化PCR产物，以将PhusionHotstartIIDNA聚合酶去除。
PhusionHotstartIIDNA聚合酶的任何残留都可能降解A尾，再次产生平末端。
所得PCR产物的后续TA克隆操作指南可在我们的相关网站上找到（)。
5.2Phusion人源样本PCR缓冲液 试剂盒中所配备的2xPhusionPCR缓冲液已经针对人源样本进行过严格优化。
它包含了dNTPs和终反应浓度为1.5mM的MgCl2。
5.3稀释缓冲液 稀释缓冲液与DNARelease一起使用可促进各种人源样本释放DNA，该缓冲液已经过严格优化（详见5.4）。
5.4DNAReleaseTM添加剂 DNARelease添加剂在稀释法中使用，它能促使人源样品中DNA的释放。
5.5引物 我们所推荐的引物最终浓度是0.5μ
M。
引物Tm值的计算结果会随着使用方法的不同而不同。
请使用我们网站上（）的Tm计算器和操作指南计算引物的Tm值，并最终确定最适的退火温度。
6.循环条件说明 6.1初始变性 使用直接PCR法，初始变性时间需要延长到5min，以使细胞裂解，基因组DNA释放。
6.2变性 保持变性时间尽可能短。
对于大多数模板，通常在98℃保持1s就足够了。
注意：变性时间和温度可能会随着热循环仪的缓变率和温度控制模式而改变。
6.3引物退火 对于Phusion人源样本DNA聚合酶，最佳的退火温度与其他基于Taq的聚合酶有着明显不同。
请使用我们相关网站（)上的Tm计算器和操作指南确定特定引物的Tm值和最适的退火温度。
设置引物退火温度的基本原则是：若引物>20nt，则退火程序设置为：Tm+3℃，5s，该Tm值指两引物中较低的那一个Tm值；若引物所含碱基数<=20nt，则直接使用两引物中较低的那一个Tm Page4 值作为退火温度。
如果有必要，可以使用温度梯度找到每一对模板/引物的最适退火温度。
退火梯度可以扩展到延伸温度（两步法PCR）。
对于Tm值较高的引物对（Tm至少在69-72℃），建议使用无退火步骤的两步法循环。
6.4延伸 延伸应该在72℃的温度下进行。
对于片段小于或等于1kb的扩增子，延伸时间建议设置成15s，对于片段大于1kb的扩增子，延伸时间建议按照15s/kb进行设置。
7.对照反应 7.1使用对照引物进行直接PCR对照反应 我们建议无论使用直接法还是稀释法进行直接PCR实验，最好设置对照反应，对照引物随试剂盒提供，模板可使用实际实验所要检测的样品。
对照引物是溶解于水中的兼并引物混合物，可扩增哺乳动物基因组DNA中237bp的片段。
该扩增区位于SOX21基因3上游，为高度保守的非编码区。
每一种引物的浓度是25μ
M。
引物1（24—mer）：5’-AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG-3’，熔点：73.5°
C 引物2（27-mer）：5’-GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA-3’熔点:72.2°C(R=A),75.3°C(R=G) 表
3.对照反应的加样指南 组份 20μl反应 体系 H2O 定容至20μl 2xPhusion®人源样本PCR缓冲液 10μl 通用对照引物混合物 0.4μl Phusion®人源样本DNA聚合酶 0.4μl 样本量（详见第4部分） 直接法： 加入量随 样本而异 稀释法： 0.5μl 50μl反应体系 定容至50μl25μl1μl1μl 加入量随样本而异 1.25μl 表
4.对照反应的循环程序设置说明 循环步骤 温度 时间 细胞裂解 98℃ 5min 变性退火/延伸 98℃ 1s 72℃ 15s 最后延伸 72℃ 1min 4℃ 保持 循环数1 35-40
1 图
1.从各种人源样本中扩增237bp的DNA片段。
将不同样本直接置于20μlPCR反应体系中。
用试剂盒中的对照引物混合物进行扩增。
泳道1：口腔拭子；泳道2：头发；泳道3：牙齿；泳道4：指甲；泳道5：唾液；泳道6：羊水。
+和-分别代表含有纯化DNA模板和未含纯化DNA模板的对照。
7.2阳性对照和阴性对照 阳性对照：当对反应条件进行优化时，建议设立一个阳性对照以确保PCR条件最优，该对照以经过纯化的DNA为模板，使用您自己的引物进行PCR扩增。
若阳性对照扩增失败，则需在进行下一步实验之前对PCR条件进行优化。
阴性对照：建议对所有直接PCR实验都加一个 Page5 没有模板的阴性对照。
8.疑难解答指南 无扩增产物或者产物量很少常见原因： 若阳性对照（使用您自己的引物扩增经过纯化的DNA），扩增完成后检测无产物，则建议： ●确保加样无误，所用循环程序与我们推荐的程序一致。
●检查引物设计。
●优化退火温度（进行温度梯度试验）。
●试验不同浓度的模板量。
●优化变性时间。
●增加延伸时间。
直接法：若您的目的检测管没有扩增产物，但阳性对照管（使 用您自己的引物扩增经过纯化的DNA模板）和直接PCR对照反应管均有扩增产物，则建议： ●将PCR反应体积增加到50μl。
●对于液体样本：试验不同浓度的模板量（例如：如果是 唾液样本，总反应体系为20μl，则唾液的加入量在0.2-0.5μl中进行试验）。
●对于固体样本：使用尽可能少的样本材料（如0.35mm大小的小块）或者尝试充分磨碎样本。
●使用稀释法。
稀释法：若您的目的检测管没有扩增产物，但阳性对照管（使 用您自己的引物扩增经过纯化的DNA模板）和直接PCR对照反应管均有扩增产物，则建议： ●可用水或者TE对上清进行1:10或者1:100的稀释，然后取0.5μl稀释后的上清充当扩增模板。
或者直接使用未稀释的上清做模板（20μlPCR反应体系最多可以加2μl上清）。
●稀释反应可在较高的温度下进行，而不是室温（温度最高可设置到65℃）。
●确保进行了98℃孵育的操作（详见4.1）。
●对于FFPE样本，尝试在60℃孵育更长时间（过夜）。
确 保进行了第二次孵育操作，即98℃的孵育。
●在稀释反应中试验不同的样本量（不同尺寸或体积）。
●在稀释反应中，使用充分磨碎的样本材料。
产物非特异——呈现高分子量弥散条带或者低分子量分散带。
●增加退火温度或者进行温度梯度试验。
●减少总循环数。
●降低引物浓度。
●缩短延伸时间。
●重新设计引物。
9.参考文献
1.NordK.etal.(1997)NatureBiotechnol.15:772−777.
2.WikmanM.etal.(2004)ProteinEng.Des.Sel.17:455−562.
3.WoolfeA.etal.(2005)PLoSBiology3:116−130. 运输和贮存 Phusion人源直接PCR试剂盒于冰上运输。
到货后即将所有组分放入-20℃贮存。
稀释缓冲液解冻后，可于4℃贮存。
若贮存条件和处理方法得当，该试剂盒的有效期为1年。
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稀释缓冲液一旦解冻可放于4°C保存。
1.简介 ThermoScientificPhusion®人源样本直接PCR试剂盒可直接以各种人源样本为模板进行PCR，而无需DNA的纯化。
如口腔拭子、唾液、指甲、牙齿、毛发，羊水和皮肤活体组织都可以作为实验的起始材料。
该试剂盒适用于新鲜、冷冻，甚至是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人源组织样本。
注意：本产品仅适用于实验室研究。
Phusion人源样本直接PCR试剂盒提供改良的Phusion®热启动II高保真DNA聚合酶。
该酶是一种特殊的工程酶，融合有DNA双链结合蛋白，不但聚合能力强，而且对许多人源样本中的PCR抑制剂表现出超强的抵抗力。
Phusion人源样本直接PCR试剂盒包含了适用于直接法和稀释法两种实验方案的所有试剂。
针对不同的实验材料提供不同的操作指南（详见第4节的操作流程选择）。
当使用新的引物对或者样品材料时，推荐首先使用稀释法方案。
该试剂盒提供对照引物，可用以扩增来自人源样本的237bp片段。
该试剂盒通常用于终点PCR。
重要提示 变性温度为98°
C。
退火温度与众多常规DNA聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）不同，具体请参照6.3。
延伸时，若扩增子片段≤1kb，则延伸时间设定 为15s即可；若扩增子片段>1kb，则按15s/kb设定延伸时间。
将样品直接加入PCR反应液中而不是空白管中。
PhusionDNA聚合酶产生的是平末端DNA产物。
2.包装信息 组分 Phusion®人源样本DNA聚合酶2xPhusion®人源样本PCR缓冲液(包含dNTPsandMgCl2)通用对照引物（每种25μM）稀释缓冲液DNAReleaseTM添加剂 材料安全数据表见 80μl2x1ml 40μl2x5ml3x100μl
3.PCR操作指南 使用前请对各管小心混匀并离心，以保证均质，提高产物得率。
PCR体系的建立可在室温下完成。
注意：请于最后将样品加到反应体系中。
请参照第４节的样品处理指南。
Page1 表
1.加样指南 组份 20μl反应 体系 H2O 定容至20μl 2xPhusion®人源样本PCR缓冲液 10μl 引物A引物BPhusion®人源样本DNA聚合酶 xμlxμl 0.4μl 样本量（详见第4部分） 直接法： 加入量随样本而异 50μl反应体系 定容至50μl25μlxμlxμl1μl 加入量随样本而异 终浓度 1x0.5μM0.5μ
M 稀释法： 0.5μl 1.25μl 表
2.循环扩增程序推荐 循环 两步法 三步法 步骤温度 时间温度 时间 起始 98℃ 5min98℃ 5min 变性 变性 98℃ 1s98℃ 1s 退火（详- -X℃ 5s 见6.3） 延伸（详72℃15s≤1kb72℃15s≤1kb 见6.4） 15s/kb> 15s/kb> 1kb 1kb 最后 72℃ 1min72℃ 1min 延伸 4℃ 保持4℃ 保持 循环数1 35-40
1 4.样品处理指南 4.1样品类型及相应的操作方法 该试剂盒已经过优化，适用于多种人源样本。
请参考4.2人源样本列表。
每一种样本材料都有其专门的实验方案。
4.2固体样本 4.2.1口腔拭子（如，尼龙绒拭子） a）直接法：使用HarrisTMUni-Core取样工具（可单独提供），打出一个直径约0.5mm的圆孔样品，然后将其直接放入20μlPCR反应液中。
在某些实验中，将反应体积增加到50μl或者将样品直径减少到0.35mm有利于获得更好的实验结果。
b）稀释法：将口腔拭子的末端插入含有50μl稀释缓冲液，1.5μlDNAReleaseTM添加剂和250μlTE（pH8.0）的1.5ml离心管中，旋转5-10次，然后轻轻地对着管壁挤压拭子的末端，取出拭子。
涡旋振荡混匀并离心。
将离心管置于98℃温浴2分钟，再次离心，然后取0.5μl上清做模板，在20μlPCR反应体系内进行扩增。
注意：拭子的使用技巧和贮存条件（不能太干燥）可能影响产物得率。
4.2.2头发 a）直接法：取1-2mm带毛囊的头发，将其直接加入20μl的PCR反应体系中。
在某些实验中，将反应体积增加到50μl有利于获得更好的实验结果。
b）稀释法：将２-３mm带毛囊的头发放入含有20μl稀释缓冲液和0.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保头发浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
4.2.3牙齿 a）直接法：取尺寸如右黑点(·)大小的牙齿，将其直接加入20μl的PCR反应体系中。
注意：当扩增DNA片段大于1kb时，建议使用稀释法进行PCR扩增。
b）稀释法：将约13-15mg的牙齿样本放入含有50μl稀释缓冲液和1.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保牙齿浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
Page2 注意：如果样本被充分磨碎，实验效果会更好，例如提升反应的灵敏度。
可以使用研钵或者匀浆器于液氮内磨碎样本。
4.2.4皮肤活体组织（未固定） a）直接法：使用HarrisTMUni-Core取样工具（可单独提供），打出一个直径约0.5mm的圆孔样品，然后将其直接放入20μlPCR反应液中。
在某些实验中，将反应体积增加到50μl或者将样品直径减少到0.35mm有利于获得更好的实验结果。
b）稀释法：将直径2mm的皮肤小块放入含有20μl稀释缓冲液和0.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保样本浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
4.2.5指甲 a）直接法：取一小块样本（大约1x2mm，或者<1mg），将其直接放入20μl的PCR反应液中。
注意：当扩增DNA片段大于1kb时，建议使用稀释法进行PCR扩增。
b）稀释法：将约7mg的指甲样本放入含有50μl稀释缓冲液和1.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中，确保样本浸没在溶液中。
涡旋振荡混匀并离心。
将其于室温下放置2-5分钟，而后在98℃孵育2分钟，再次离心，取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系内扩增。
注意：如果样本被充分切碎，实验效果会更好，例如可以提高反应的灵敏度。
4.2.6福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织样本 a）直接法：不推荐。
b）稀释法：FFPE组织切片：将一块约7-10μm厚的FFPE人源组织样本放入 含有50μl稀释缓冲液，1.5μlDNAReleaseTM添加剂和50μlTE（pH8.0）的反应管中，*用枪头捣碎组织，并离心，确保样本浸没在溶液中。
将反应体系置于60℃孵育1h，而后在98℃孵育10分钟，冷却后离心（16000xg,2min），转移上清到一个新的离心管中。
取0.5μl上清做模板，于20μlPCR反应体系进行扩增。
在某些实验中，如果上清中的组织碎片或者DNA量非常高，建议稀释上清。
可用水或者TE对其进行1:10或者1:100的稀释。
然后取0.5μl稀释后的上清加入20μlPCR反应体系，进行扩增。
FFPE组织显微切片（未染色）：将稀释缓冲液和TE（pH8.0）缓冲液按1:1的体积比进行混合。
充分振荡后吸取100μl混合液加到4-7μm厚的FFPE组织显微切片上，用枪头将玻片上的组织刮离，并将溶液和组织一同转到干净离心管中，并加入1.5μlDNAReleaseTM添加剂。
*用枪头吹打溶液，并离心。
确保样本浸没在溶液中。
将其于60℃孵育1h，接下来在98℃孵育10min，冷却后离心（16000xg,2min），转移上清到一个新的离心管中。
取0.5μl上清加入到20μlPCR反应体系内，进行扩增。
在某些实验中，如果上清中的组织碎片或者DNA量非常高，建议稀释上清。
可用水或者TE对其进行1:10或者1:100的稀释。
然后取0.5μl稀释后的上清置于20μlPCR反应体系，充当扩增模板。
注意：通常FFPE组织中的DNA会被片段化，故能够被成功扩增的PCR产物长度有限。
我们建议扩增子最好小于300bp。
对于某些实验，如果第一步的孵育时间从1小时延长至过夜，可提高PCR产物的得率。
4.3液体样本 4.3.1唾液 a）直接法：取0.2–0.5μl唾液直接加入20μl的PCR反应体系中。
b）稀释法：取5μl唾液样本加入含有20μl稀释缓冲液和0.5μlDNAReleaseTM添加剂的反应管中。
Page3 涡旋振荡混匀，并离心。
将其于98℃孵育2min，再次离心后取0.5μl上清加入到20μlPCR反应体系内，进行扩增。
注意：推荐使用新鲜的唾液样本。
如果需要在PCR前将唾液样本贮存一段时间，建议使用商用唾液收集管（如Oragene®.DNAfromGenotek）。
4.3.2羊水 a）直接法：取0.5–2μl羊水直接加入20μl的PCR反应体系中。
b）稀释法：不推荐。
5.各反应组分说明 5.1酶 Phusion人源样本DNA聚合酶是一种带有独特结构域的具有校正功能的聚合酶，该结构域大大增强了酶的处理能力，赋予了其强劲、快速和精准的特性。
该酶的热启动技术是基于可逆结合Affibody®蛋白的失活技术1，
2。
Phusion人源样本DNA聚合酶具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。
当使用Phusion人源样本DNA聚合酶扩增克隆片断时，我们推荐使用平末端克隆。
如果需进行TA克隆，可以使用诸如DyNAzymeTMIIDNA聚合酶（F-501）给平末端PCR产物加A尾。
但是在加A尾之前，请务必纯化PCR产物，以将PhusionHotstartIIDNA聚合酶去除。
PhusionHotstartIIDNA聚合酶的任何残留都可能降解A尾，再次产生平末端。
所得PCR产物的后续TA克隆操作指南可在我们的相关网站上找到（)。
5.2Phusion人源样本PCR缓冲液 试剂盒中所配备的2xPhusionPCR缓冲液已经针对人源样本进行过严格优化。
它包含了dNTPs和终反应浓度为1.5mM的MgCl2。
5.3稀释缓冲液 稀释缓冲液与DNARelease一起使用可促进各种人源样本释放DNA，该缓冲液已经过严格优化（详见5.4）。
5.4DNAReleaseTM添加剂 DNARelease添加剂在稀释法中使用，它能促使人源样品中DNA的释放。
5.5引物 我们所推荐的引物最终浓度是0.5μ
M。
引物Tm值的计算结果会随着使用方法的不同而不同。
请使用我们网站上（）的Tm计算器和操作指南计算引物的Tm值，并最终确定最适的退火温度。
6.循环条件说明 6.1初始变性 使用直接PCR法，初始变性时间需要延长到5min，以使细胞裂解，基因组DNA释放。
6.2变性 保持变性时间尽可能短。
对于大多数模板，通常在98℃保持1s就足够了。
注意：变性时间和温度可能会随着热循环仪的缓变率和温度控制模式而改变。
6.3引物退火 对于Phusion人源样本DNA聚合酶，最佳的退火温度与其他基于Taq的聚合酶有着明显不同。
请使用我们相关网站（)上的Tm计算器和操作指南确定特定引物的Tm值和最适的退火温度。
设置引物退火温度的基本原则是：若引物>20nt，则退火程序设置为：Tm+3℃，5s，该Tm值指两引物中较低的那一个Tm值；若引物所含碱基数<=20nt，则直接使用两引物中较低的那一个Tm Page4 值作为退火温度。
如果有必要，可以使用温度梯度找到每一对模板/引物的最适退火温度。
退火梯度可以扩展到延伸温度（两步法PCR）。
对于Tm值较高的引物对（Tm至少在69-72℃），建议使用无退火步骤的两步法循环。
6.4延伸 延伸应该在72℃的温度下进行。
对于片段小于或等于1kb的扩增子，延伸时间建议设置成15s，对于片段大于1kb的扩增子，延伸时间建议按照15s/kb进行设置。
7.对照反应 7.1使用对照引物进行直接PCR对照反应 我们建议无论使用直接法还是稀释法进行直接PCR实验，最好设置对照反应，对照引物随试剂盒提供，模板可使用实际实验所要检测的样品。
对照引物是溶解于水中的兼并引物混合物，可扩增哺乳动物基因组DNA中237bp的片段。
该扩增区位于SOX21基因3上游，为高度保守的非编码区。
每一种引物的浓度是25μ
M。
引物1（24—mer）：5’-AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG-3’，熔点：73.5°
C 引物2（27-mer）：5’-GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA-3’熔点:72.2°C(R=A),75.3°C(R=G) 表
3.对照反应的加样指南 组份 20μl反应 体系 H2O 定容至20μl 2xPhusion®人源样本PCR缓冲液 10μl 通用对照引物混合物 0.4μl Phusion®人源样本DNA聚合酶 0.4μl 样本量（详见第4部分） 直接法： 加入量随 样本而异 稀释法： 0.5μl 50μl反应体系 定容至50μl25μl1μl1μl 加入量随样本而异 1.25μl 表
4.对照反应的循环程序设置说明 循环步骤 温度 时间 细胞裂解 98℃ 5min 变性退火/延伸 98℃ 1s 72℃ 15s 最后延伸 72℃ 1min 4℃ 保持 循环数1 35-40
1 图
1.从各种人源样本中扩增237bp的DNA片段。
将不同样本直接置于20μlPCR反应体系中。
用试剂盒中的对照引物混合物进行扩增。
泳道1：口腔拭子；泳道2：头发；泳道3：牙齿；泳道4：指甲；泳道5：唾液；泳道6：羊水。
+和-分别代表含有纯化DNA模板和未含纯化DNA模板的对照。
7.2阳性对照和阴性对照 阳性对照：当对反应条件进行优化时，建议设立一个阳性对照以确保PCR条件最优，该对照以经过纯化的DNA为模板，使用您自己的引物进行PCR扩增。
若阳性对照扩增失败，则需在进行下一步实验之前对PCR条件进行优化。
阴性对照：建议对所有直接PCR实验都加一个 Page5 没有模板的阴性对照。
8.疑难解答指南 无扩增产物或者产物量很少常见原因： 若阳性对照（使用您自己的引物扩增经过纯化的DNA），扩增完成后检测无产物，则建议： ●确保加样无误，所用循环程序与我们推荐的程序一致。
●检查引物设计。
●优化退火温度（进行温度梯度试验）。
●试验不同浓度的模板量。
●优化变性时间。
●增加延伸时间。
直接法：若您的目的检测管没有扩增产物，但阳性对照管（使 用您自己的引物扩增经过纯化的DNA模板）和直接PCR对照反应管均有扩增产物，则建议： ●将PCR反应体积增加到50μl。
●对于液体样本：试验不同浓度的模板量（例如：如果是 唾液样本，总反应体系为20μl，则唾液的加入量在0.2-0.5μl中进行试验）。
●对于固体样本：使用尽可能少的样本材料（如0.35mm大小的小块）或者尝试充分磨碎样本。
●使用稀释法。
稀释法：若您的目的检测管没有扩增产物，但阳性对照管（使 用您自己的引物扩增经过纯化的DNA模板）和直接PCR对照反应管均有扩增产物，则建议： ●可用水或者TE对上清进行1:10或者1:100的稀释，然后取0.5μl稀释后的上清充当扩增模板。
或者直接使用未稀释的上清做模板（20μlPCR反应体系最多可以加2μl上清）。
●稀释反应可在较高的温度下进行，而不是室温（温度最高可设置到65℃）。
●确保进行了98℃孵育的操作（详见4.1）。
●对于FFPE样本，尝试在60℃孵育更长时间（过夜）。
确 保进行了第二次孵育操作，即98℃的孵育。
●在稀释反应中试验不同的样本量（不同尺寸或体积）。
●在稀释反应中，使用充分磨碎的样本材料。
产物非特异——呈现高分子量弥散条带或者低分子量分散带。
●增加退火温度或者进行温度梯度试验。
●减少总循环数。
●降低引物浓度。
●缩短延伸时间。
●重新设计引物。
9.参考文献
1.NordK.etal.(1997)NatureBiotechnol.15:772−777.
2.WikmanM.etal.(2004)ProteinEng.Des.Sel.17:455−562.
3.WoolfeA.etal.(2005)PLoSBiology3:116−130. 运输和贮存 Phusion人源直接PCR试剂盒于冰上运输。
到货后即将所有组分放入-20℃贮存。
稀释缓冲液解冻后，可于4℃贮存。
若贮存条件和处理方法得当，该试剂盒的有效期为1年。
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