当前的监管、挑战和趋势
从传统培养到基于NAT的自动化高通量检测的转变
前言
生物制药产品（也被称为生物制品或大分子药物）的支原体污染是由生产过程中的细胞培养污染引起的，会给患者带来潜在的健康风险。
支原体几乎能够影响细胞培养的每一个参数，并且通常仅产生微小的可见变化，对于制药产业来说，它们是一种无法掌控的、可造成潜在损害的因素。
因此，监管部门要求制造商检测自己生产的生物制品，确保被放行出厂的产品中都不含支原体。
全球大多数药物监管部门都发布了提供支原体检测方案的相关指南，有些还对快速NAT（核酸扩增技术）检测方法的验证提出了一些建议。
但这些有关快速支原体检测的建议并不一致，导致这类检测对于药企而言成为一项挑战。
2018年1月 SebastianMachadoWeber,Dr.AndreasRohwer,AlexanderBartes,ChristinaKrause,RaphaelGreinerRocheCustomBiotechDr.Carl-UlrichZimmermann,Dr.MartinaSauert,MartinVronka,Dr.SandraBuczolits,Prof.Dr.RenateRosengartenMycoplasmaBiosafetyServicesGmbH 前言 RocheCustomBiotechMycoTOOL支原体实时PCR分析试剂盒（MycoTOOLqPCR–/mycotool）联合手动抽提试剂盒QCSamplePreparationKit，或RocheMagNAPure96/MagNAPure24样本制备系统可进行高效的生物制品支原体检测。
这种基于NAT的方法具有可自动化和速度快的优点，本文的目的在于为NAT快速支原体检测方法的验证和实施提供指导和建议。
章节概览
1.对支原体进行简单地介绍。
此外，还讨论了生物制品生产中和支原体污染相关的过程。
2.对当前用于支原体检测的药典方法和非药典方法进行了介绍和举例描述。
其中，对药典规定的培养法和指示细胞培养法，以及基于NAT的快速检测法进行了详细的介绍。
3.讨论了在支原体快速检测法的应用过程中需要考虑的监管方面的问题。
并讨论了欧洲药典（EP2.6.7.）
1、美国药典（USP<63>）2和日本药典（JP第17版）3等监管指南。
4.针对特定产品的NAT快速检测方案验证和项目的方案设计进行说明，并为每个步骤提供了相关建议。
这一章的内容涉及到一套完整流程的各个相关步骤，从供应商调查，到开展可行性和验证研究，再到日常检测的实施都被纳入其中。
5.最后一章的总结与概述描述了基于NAT的快速支原体检测法的长期应用前景。
并讨论了将这种快速方法应用在早期报警系统和批放行检测中的竞争优势，以及这些替代检测系统能够为生物制药产业带来的新机遇和受益。
关于我们 借助罗氏诊断和罗氏制药的专业技术，CustomBiotech为您的生物制药、细胞治疗或体外诊断业务提供高质量的原料、仪器和服务，全面满足您独特的质量和管理需求。
了解更多信息：(/custombiotech) MycoplasmaBiosafety是一家合约研究机构和服务提供商，专业致力于为生物制药产品开发满足GMP规定的支原体检测方法，同时也是行业内支原体学科的技术引领者。
借助于传统的培养方法和新型的快速PCR分析法，MycoplasmaBiosafety能够提供全面的支原体检测服务——支原体检测与检测方法验证开发，生产支原体培养基以及参考标准品。
了解更多信息(/mbs) 2|技术报告 目录 目录 引言�����������������������������4细胞培养中的支原体����������������������5生物药品生产过程中的支原体������������������6支原体检测方法概述����������������������8非药典检测法�������������������������8药典检测法��������������������������9基于NAT的方法�����������������������13监管概述��������������������������17罗氏MycoTOOLqPCR检测方案的逐步验证和实施���������19总结与概述�������������������������22附录����������������������������23术语表���������������������������24参考文献��������������������������26 技术报告|
3 引言 引言 “支原体”通常被用作柔膜细菌类中所有细菌的惯用名（在古英语中，mollis=“软”,cutis=“皮肤”）（图1）。
柔膜细菌的特点是没有细胞壁，基因组规模小（0.5–2.2兆碱基对），且GC（鸟嘌呤-胞嘧啶）含量低（20–40mol%）。
由于基因组较小，支原体具有宿主依赖性，需要在人类及其他脊椎动物、植物和昆虫等多种宿主的体内或体表作为共生物或病原体存活。
这种微生物在有氧或缺氧条件下都可以增殖。
它们都具有多晶细胞形态学(螺原体除外，这种支原体属具有螺旋式结构)，还有些支原体（Mycoplasmagallisepticum,Mycoplasmapneumoniae）有突出的终端，形状类似于烧瓶。
根据种类的不同，支原体可以在液体培养基中以单细胞（Mycoplasmaarthritidis）或聚合物（Acholeplasmalaidlawii,Mycoplasmapneumoniae,Mycoplasmafermentans）的形式生长
4。
由于没有细胞壁，所以支原体对青霉素等以细胞壁作为靶点的抗生素具有抵抗性。
此外，液体培养基中的支原体还可以在固体表面形成生物膜，比如玻璃或塑料表面等，由此产生另一种抵抗水平，也就是对消毒剂和环境应力条件的抵抗
5。
第一种支原体于1896年在InstitutePasteur培养成功，它是从患有胸膜肺炎的牛体内分离出来的，后来被称为丝状支原体丝状亚种/小菌落型（Mycoplasmamycoidessubsp.mycoidesSC）
6。
纲 目 枝原体目 科 支原体科 甾原体甾原体科 柔膜细菌虫原体目 螺原体科 虫原体科 厌氧原体目厌氧原体科 属支原体属*脲原体属* 甾原体属* 螺原体属 虫原体属 图1：柔膜细菌类。
用紫框标注的微生物属与生物制药产品的生产过程具有相关性。
*该属含有普遍存在于人类中的支原体。
来源：Authors，2017。
中间原体属 厌氧原体属 无甾醇原体属 由于基因组较小，所以支原体完全缺乏或部分缺乏几种常见 的代谢途径，必须从环境中获取必要的营养物（氨基酸、核苷碱基和脂肪酸），以寄生方式生存
7。
长期以来，支原体的病原体特性一直被人们低估。
出于这个原因，也没有开发出适用的分子诊断方法。
不过近年来的情况发生了很大的改变，支原体培养技术和分子检测技术的进展快速，并得到了越来越广泛的接受和应用
8。
4|技术报告 引言 细胞培养中的支原体除了在临床检测中的意义获得不断提高，支原体对细胞培养的影响也已经得到了极大的关注。
它们天然寄存于植物和动物的组织里，而各种细胞培养基都含有来源于植物或动物的补充剂。
同时支原体的体积很小，平均只有0.1–0.8μm（图2），由于没有细胞壁且形状可变，所以支原体很容易通过标准灭菌过滤器，和培养基或原料添加剂一起进入细胞培养过程。
最常见的两个污染源是实验室人员和已经受到污染的细胞培养物，这些污染物通过交叉污染作用在生产过程中继续传递
9。
由于支原体在标准光学显微镜设置下是不可见的，而且通常不会使细胞培养物的状态发生明显变化，所以一般很难观察到污染的发生。
然而，它们的存在却会影响细胞的生长和代谢，进而对宿主细胞表达的治疗性蛋白产生影响。
生物药生物制药产品（也被称为生物制品）是生产和提取自细菌、酵母、哺乳动物细胞系或哺乳动物等生物来源的医药产品。
疫苗、血液成分、重组蛋白、基因治疗、组织以及用于治疗的细胞都属于这个类别。
它们含有核酸、蛋白、糖以及由这些物质构成的复合物，与人体内天然存在的分子完全相同或者具有相似性。
与化学合成药物（通常指的是小分子）不同，生物制品的分子量要大得多，通常是小分子药物的100倍以上。
用哺乳动物细胞系进行生物制药生产通常使用基因工程技术开发出表达生物大分子的真核细胞系（如CHO或HEK293），然后进行收获、纯化和制剂。
如图3所示。
由于生产流程十分复杂，所以生物制药产品的生产和产品放行都面临着独特的挑战。
首先，细胞系可能会被支原体污染，因此批放行之前需要先进行支原体检测。
其次，由于生物制品采用过滤法除菌，所以存在支原体或病毒穿过滤膜的潜在风险。
第
三，污染物可能会通过原料进入细胞培养物。
正因为如此，支原体检测尤其是早期报警系统（也称为过程控制）是十分必要的质量控制技术，以期尽快尽早地发现污染物。
支原体细胞(0.1-0.8μm) 病毒(0.05-0.1μm) 酵母细胞(3-10μm) 细菌细胞(1-10μm) 真核细胞(10-100μm) 电子显微镜 0.1μm光学显微镜 1μm 10μm 100μm肉眼 图2：不同微生物的相对大小。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
技术报告|
5 引言 尽管理解支原体污染可能造成的生产损失和质量影响、尽管明白支原体污染的检测是十分必要的过程质控环节，但在实际生产过程中仍然少有公司对细胞培养物进行监测。
研究发现，在全球范围内的可用细胞系中，其污染率大约是5–35%10,11,12。
对于防止细胞培养物被支原体污染的目标而言，只有定期检测支原体才是最具有实践性和防范作用的手段。
在生产流程中，只有严格的常规性支原体检测才能预防隐蔽的支原体污染，将它们造成严重后果的风险降到最低13。
由于相关的检测方法以及对检测结果的解释都需要通过培训和不断地积累经验才能掌握，所以支原体检测通常无法在生产商内部有效进行。
将支原体的检测工作托付给经验丰富、值得信任的合同合作伙伴具有很多优势。
首先，这种做法可以在尽可能短的时间内取得有效的检测结果。
其次，不需要建立和维持内部检测部门，从而将更多的资源应用在核心业务上。
最后一个极为重要的优势在于，可以避免因为引入阳性对照品而导致支原体污染的潜在风险。
生物药品生产过程中的支原体 在生物制药行业，支原体污染产生的影响几乎具有毁灭性，例如整批产物都必须丢弃，生产车间也必须停产整顿14。
国际监管机构发布的指南已经阐明，为了确保产品的安全性、纯度和产品效力，生物制药产品中不能存在支原体污染。
因此，为了确保整个生产流程的平稳，必须尽早实施支原体检测。
图3显示的是常见的检测点。
人们根据这些不同的检测点开发了多种支原体检测方法，后文将对它们进行讨论。
细胞治疗前沿治疗性药物（Advancedtherapymedicinalproducts,ATMP）是一类以基因（基因治疗）、体细胞（细胞治疗）或组织（组织工程）为基础的新型治疗药物。
这些前沿药物为多种疾病提供了新的治疗方法，它们将为患者带来巨大的福音。
细胞治疗通常需要从患者身上分离细胞，然后进行体外细胞培养，再将细胞注入患者体内。
与大分子生物制品相比，细胞治疗产品的生产和放行还面临着其他挑战。
首先，其中大部分药物根本无法灭菌。
其次，细胞治疗药物的有效期通常很短，需要立即注入患者体内。
第
三，这种药物的批产量通常只有一倍剂量率，量非常少。
在这种情况下，支原体快速检测法比常规支原体检测法更受欢迎，因为前者所需的检测样品量相对较少，且对生产批次的放行速度快于常规支原体检测法。
6|技术报告 引言 原材料 缓冲液制备 细胞培养液 种子培养 发酵+澄清 收获 纯化 制剂 行业要求 必要检测点 推荐的生产过程控制点 监管部门要求 图3：生物制药生产过程中的支原体污染检测点。
原料的污染物检测结束之后（灰色圈），加入缓冲液或培养基开始进行细胞培养，此时也需要进行污染检测（蓝色圈），因为支原体可能会通过细胞系或实验室人员进入生产流程。
建议在种子培养和实际发酵过程中开展生产过程控制（淡紫色圈）。
发酵结束时还要进行最后一次检测，这也是监管部门要求开展检测的一个时间点（紫色圈）。
在证实了收获液中不含支原体以后，由于产品的纯化处理是在不含活性微生物的条件下进行的，所以通常不需要再实施检测。
来源：RocheCustomBiotech,2017. 在细胞培养或生物制药生产的过程中，经常或可能会出现、并且被视为主要污染种属的支原体如表1所示。
对于生产过程来说，支原体污染产生的影响不仅会导致产品质量下降， 还会降低表达水平并由此降低产量。
质量不佳和支原体污染的生物制品可能致使患者产生严重的副作用15,16。
MycoplasmaspeciesAcholeplasmalaidlawii 主要来源（与使用以下来源的原料生产出来的产品相关） 牛、猪、禽类、植物 已发表报告提到的常见细胞培养污染物 是 Mycoplasmaarginini 牛，绵羊，山羊，猪 是 Mycoplasmabovis 牛 是 Mycoplasmafermentans 人 是 Mycoplasmagallisepticum 禽类 否 Mycoplasmahyorhinis 猪 是 Mycoplasmaorale 人 是 Mycoplasmasalivarium 人 是 Mycoplasmasynoviae 禽类 否 Spiroplasmacitri 植物 否 表1：在细胞培养和生物制药过程中经常、偶尔或可能会检测到的支原体种类。
潜在污染源 其他细胞系，牛血清，营养肉汤粉末 其他细胞系，牛血清其他细胞系，牛血清其他细胞系，人其他细胞系，鸡胚其他细胞系，猪胰蛋白酶其他细胞系，人其他细胞系，人其他细胞系，鸡胚其他细胞系 技术报告|
7 支原体检测方法概述 支原体检测方法概述 支原体的检测对于细胞培养过程和生物制药的质量控制而言是一项挑战，因为只有具备专业技能和丰富经验的工作人员才能发现它们，尤其是低水平的污染更是如此。
在最近十年里，有两种经典的方法被用于常规支原体检测，它们的灵敏度和可靠性已经获得了证实：（i）培养法（也被称为琼脂肉汤法），（ii）指示细胞培养法。
有些基于酶或免疫学的非药典分析法具有速度快和容易实施的优点，但它们的灵敏度都不如培养法。
因此，药典专论认为这些检测方法不能替代常规检测。
在过去几年里，对速度快、灵敏度高且稳健性高的支原体检测法的需求迫切性日益增加，因为经典培养法的所需时间过长， 可能会耽搁产品的放行，并由此产生高昂的费用。
EP指南指出，如果NAT检测方案的灵敏度能达到与经典培养法相同的水平，并且具有良好的稳健性和特异性，则可以用NAT作为支原体检测方案替代经典培养法。
本章对用于支原体检测的非药典方法和药典方法进行了概述。
并介绍了NAT方法及罗氏MycoTOOLqPCR检测方案。
罗氏MycoTOOLqPCR检测方案已经通过了EP支原体NAT验证指南规定的所有的必要相关标准，可以替代指示细胞培养法和培养法。
非药典检测法用于检测支原体的非药典方法通常灵敏度较低，无法在监管要求的支原体污染水平下限进行检测。
如果支原体污染的水平较低，检测的结果有时候还会难以解释。
这些检测较易产生假阴性结果。
直接DNA染色用DNA（脱氧核糖核酸）特异性荧光染料对细胞培养物直接染色并进行观察，但不建议将该方法用于检测支原体污染。
这种检测方法能可靠地检测重度污染培养物，但该方法很难判定被支原体轻度污染的培养物，因为细胞培养物的DNA也可能会产生荧光小点，与支原体具有相似性17。
基于酶的检测方法基于酶的分析方法是一种具有选择性的生化检测，其检测原理在于利用了支原体酶的活性。
将这种方法用于常规支原体检测的前提条件是被检测的酶仅在各种支原体中广泛存在 并具有活性，而不存在于真核细胞基质中。
比如基于荧光素酶的支原体检测分析18,19，虽然这种方法具有速度快（<20min）、操作相对容易（两个发光读数）、结果容易解释的特点，但它们的检测限都达不到药典要求的水平[<10CFU（集落形成单位）/ml]。
大多数支原体都可以在104-105CFU/ml的滴度范围内被检测出来20。
PCR-ELISA检测MycoplasmaPCR-ELISA检测方法是一种将细胞培养物中支原体DNA进行PCR扩增后与ELISA（酶联免疫吸附测定法）相结合的分析法21。
在PCR反应过程中，用地高辛标记的核苷酸被整合到扩增子里，能够在ELISA分析中被检测出来。
有文献表明对于特定种类的支原体（如M.fermentans和A.laidlawii），PCR-ELISA检测的灵敏度水平可以达到1-3个支原体“微粒”22。
但是，这种方法对其他支原体的检测限（LOD）是每mL样本1000个支原体“微粒”，无法达到EP监管指南的相关要求。
8|技术报告 支原体检测方法概述 药典检测法药典中提及的支原体检测方法涉及了使用液体培养基和固体琼脂培养基的经典微生物培养法，以及采用了分子技术的快速检测方法。
这些方法的摘要见本章内容和表
2。
方法培养法 优势 灵敏度可达到0.1CFU/ml的检测限 劣势 培养期长达28天使用多种培养基对不同的支原体种类进行检测标准支原体培养基检测不到难培养的M.hyorhiniscultivaralphastrains 指示细胞培养法 成本较低 培养期长达7天灵敏度较低 基于NAT的方法 灵敏度至少达到<10CFU/ml的检测限快速 检测结果的可靠性高度依赖于样本制备和DNA提取的质量和效率需要DNA提取试剂盒与核酸扩增和检测设备/仪器需要验证与培养法和指示细胞法可比性 表2：药典支原体检测方法的优点与缺点。
培养法在当代分子检测技术出现之前，传统的培养方法一直是微生物检测的金标准，至今为止，全球范围内仍将它作为支原体常规检测方案和药典方案（EP、USP和JP监管指南都包含这种方法）。
培养法以支原体的定向培养为基础，使用能够促进支原体生长的培养基。
将需要检测的样本接种到支原体的液体培养基和琼脂上，在温度为36±1°
C、CO2含量为5.5±0.5%、O2含量为3±1%、相对湿度为90±5%的微氧条件下培养，以促进支原体生长。
到了初次接种后的第21天，将 液体培养基的传代培养物接种到琼脂平板上。
支原体会在琼脂培养基上形成微小的集落（直径<100–400μm）。
支原体集落的形态具有多样性，既有典型的煎蛋形，也有较不规则的形状（图4）。
支原体集落可能非常小，在显微镜下统计和判断菌落的工作要求实验室工作人员具备相关的经验。
图5是培养法的示意图。
技术报告|
9 支原体检测方法概述 图4：在不同支原体琼脂培养基上生长的各种支原体形成的集落以及参照野生株。
来源：MycoplasmaBiosafetyServicesGmbH,Dr.Carl-UlrichZimmerman,2016 由于培养法所需的样本体积相对较大（10ml），培养期较长（一共28天），所以培养法是灵敏度最高的检测方法之
一，其检测限的理论值和实测值都达到0.1CFU/ml，即1CFU/10ml样本。
这种方法满足EP2.6.7提出的能够在10CFU/ml的支原体污染水平进行检测的要求，因此目前仍然被全球各国列在监管文件中用作参照方法。
但培养法有一些不足之处，其中最主要 的问题是培养期长达28天。
这么长的培养期会给很多药物生产商带来严重的困扰，比如产品放行被推迟，产生高昂的储存费用，检测原料、细胞系以及上下游处理的过程控制涉及的大量物流工作，以及由此产生的高昂人工费用等。
培养法的另一个局限性在于需要使用几种不同的生长培养基，因为并非所有类型的支原体都能在同一种培养基里存活。
由此，根据样本来源 10|技术报告 支原体检测方法概述 0.2ml阴性质控品>14天 集落计数 样本 10mlin 100ml 0.2ml 阴性质控品 0.2ml 阳性质控品 0.2ml day2-4day6-8day13-15day19-21 集落计数 图5：MycoplasmaBiosafety按照EP2.6.7.的要求实施的培养法检测示意图。
取200μl待测样本涂布固体支原体生长培养基上，再取10ml待测样本接种到100ml液体生长培养基中，检测是否存在支原体污染。
以没有接种的培养基作为阴性对照品，接种量≤100CFU的培养基作为阳性对照品。
将液体培养基培养20–21天。
在接种后第2–4天、6–8天、13–15天和19–21天，取200μl样本接种的培养基以及阴性对照品和阳性对照品涂布在琼脂培养基上。
接种后的琼脂培养基至少要培养14天，但对应于20-21天传代培养的培养基除外，它们的培养时间为7天。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
的不同，需要同时使用不同的支原体培养基，以扩大可检测的支原体种类范围。
出于这个原因，EP2.6.7.建议至少使用两种标准支原体培养基：用于检测非禽类支原体的FRIIS培养基和用于检测禽类支原体M.synoviae的FREY培养基。
而培养法最大的局限性可能在于部分支原体菌株的高度苛养性，例如猪鼻支原体M.hyorhiniscultivaralphastrains（以M.hyorhinisDBS1050 作为参照株）等，由于蛋白胨和酵母产物对其具有生长抑制作用，导致它们不能在标准培养基里生长23。
这些细胞培养基适应性菌株的生长情况取决于其各自细胞培养的生境。
为了检测M.hyorhiniscultivaralphastrains，需要用到指示细胞培养法。
技术报告|11 支原体检测方法概述 指示细胞培养法指示细胞培养法通常以Vero或3T3细胞系进行检测，但EP监管指南也允许使用具有相同效果的生产细胞系检测支原体。
用样本接种指示细胞培养基之后，在35–38℃的温度下培养，直至细胞汇合。
对于阳性对照品，也可以在存在或不存在被测样本的条件下，用M.orale和M.hyorhiniscultivaralphareferencestrain接种指示细胞系。
染色前，先用固定液将传代 培养物固定，再用能够与DNA结合的荧光染料染色。
支原体存在的特征是细胞表面的荧光模式呈球形，且周围区域散发出强烈荧光。
细胞质中的线粒体也会被染色，但很容易就能将它们与支原体区分开来。
如果阳性对照品没有呈现出典型的支原体荧光模式，或者阴性对照品呈现出典型的支原体荧光模式，则检测无效。
图6是指示培养法的示意图。
阳性质控品 阳性质控品 1ml 1ml样本 1ml样本 + 样本 口腔支 猪鼻 原体 支原体 ≤100CFU≤100CFU 阳性质控品 口腔支原体≤100CFU 10ml 荧光显微镜镜检 阳性质控品 猪鼻支原体≤100CFU 阴性质控品 阳性质控品：Vero细胞+猪鼻支原体 阴性质控品：Vero细胞 图6：MycoplasmaBiosafety实施的指示细胞培养法检测。
在新鲜制备的Vero指示细胞培养物中接种1ml待测样本。
准备四份阳性对照品。
两份阳性对照品含有用1ml样本接种的Vero细胞，并分别接种不超过100CFU的猪鼻支原体和口腔支原体。
另外两份阳性对照品则是不含样本、用不超过100CFU的猪鼻支原体和口腔支原体接种的Vero细胞。
取后者的这两份阳性对照品涂布在琼脂培养基上，检查支原体活力。
阴性对照品为未接种样品和阳性支原体的新鲜制备Vero细胞。
所有细胞培养物放在CO2恒温箱中培养，直至达到100%的细胞汇合度为止。
然后用缓冲液冲洗细胞层并进行胰酶处理。
将脱落的细胞重新悬浮于细胞培养基里，转移至腔室培养玻片，在CO2恒温箱里培养，直到细胞密度达到约50%为止。
用新制固定液将细胞层固定两次，然后风干，用Hoechst染色法染色后用荧光显微镜进行观察分析。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
12|技术报告 支原体检测方法概述 培养法和指示细胞培养法都需要很长的时间才能得出结果（培养法需要28天，指示细胞培养法需要7天），同时由于引入了阳性对照品或可能的支原体阳性样本，所以这些方法本身就存在导致设备发生支原体污染的风险。
基于NAT的方法在基于NAT的方法学中，所有试验都以核酸检测为基础。
通常采用PCR技术来进行核酸检测。
PCRPCR是一种可用于多个领域的分子生物学方法，包括食品和环境分析、法医学以及医学诊断等。
其原理是对DNA进行特异性的扩增处理，使之达到可以检测的水平。
扩增时使用DNA聚合酶，用热循环仪进行多个周期的自动化扩增处理。
每个扩增周期都包括三个主要步骤： 为了开发出灵敏度高、特异性好或者所需时间更短的PCR分析法，需要对PCR温度方案进行优化。
例如，降落PCR（TD-PCR）就是一种很常用的方法，它可以提高PCR分析目标基因的特异性。
TD-PCR中引物在最开始的几个PCR循环中可以在较高的退火温度下与目标DNA序列发生具有高度特异性的结合，从而确保只有特定的DNA序列得到扩增。
然后逐渐降低退火温度，使PCR效率达到最高水平。
TD-PCR方案可以减少非特异性DNA的合成24。
MycoTOOLqPCR通过TD-PCR技术实现具有高度特异性的支原体检测。
1.加热使双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA)。
2.让PCR引物与特定的ssDNA位点（例如，特定的目标基因）相结合。
3.以退火结合的引物序列为起始点，DNA聚合酶按照ssDNA的序列进行延伸，合成互补的DNA序列。
如需了解关于常规PCR发展为qPCR的历史、技术进展情况和其他更多信息，请访问： 如需了解更多信息，请查看详细的PCR流程： （/dnacopy） 一般而言，经过30–50个PCR周期的扩增处理后，所得到的特异性DNA扩增子足以用荧光染料染色，进行凝胶电泳分析，或用其他方法对荧光信号进行检测。
（/storypcr） 相比于普通PCR，实时PCR（qPCR）能够实时报告DNA的扩增情况。
因此，实时PCR不需要在PCR处理后用凝胶电泳等方法检测DNA，大幅降低了在实验室里发生污染的风险，并且有助于对最终结果进行解释。
实时PCR使用的探针含有与短DNA序列（18-30个碱基对）相连接的荧光染料。
这种探针在PCR的每个扩增循环中都会被纳入新合成的DNA互补链。
市场上有多种不同的探针设计可供选择，其中最常见的探针之一就是MycoTOOLqPCR使用的水解探针。
在每个PCR循环结束后，这种探针都会以荧光强度的形式报告DNA的总量。
随着目标序列的不断扩增，荧光信号的强度也会成比例地升高。
将荧光强度与PCR循环数对应作图，就可以得到一条典型的S状qPCR曲线（见图7）。
技术报告|13 支原体检测方法概述 PCR和qPCR的检测灵敏度都很高，如有DNA污染的发生，则容易造成假阳性的报告结果。
最常见的污染源是DNA模板自身，以及PCR反应结束后产生的DNA扩增产物。
DNA分子可以通过空调系统或实验室人员在实验室里传播。
消除这些污染源最有效的方法是在单独的工作区域或单独的房间里，以单向工作流的方式完成从采样、样本处理、反应液配置直至PCR扩增和PCR产物检测的工作流程25。
MycoTOOLMycoplasmaReal-TimePCR试剂盒(MycoTOOLqPCR) MycoTOOLReal-TimePCR试剂盒是一种qPCR分析法，特别适用于细胞培养物的支原体检测。
它完全满足EP2.6.7.对NAT支原体检测法提出的有关灵敏度（例如，检测限≤10CFU）、特异性、稳健性以及一致性的要求。
并且不需要进行支原体富集或预培养处理。
该试剂盒使用的引物和探针对支原体16S核糖体DNA基因具有高度特异性，能够检测150多种可以培养以及不可培养的支原体，包括细胞培养物中的常见支原体污染物种类以及可能会出现的污染种类，如莱氏衣原体、精氨酸支原体、发酵支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、唾液支原体、关节液支原体以及柠檬螺原体（表1），还有肺炎支原体和人型支原体等致病性人支原体。
ΔRn 54.61749.61744.61739.61734.61729.61724.61719.61714.617 9.61794.6170.383 51015202530354045循环 图7：MycoTOOLqPCR支原体检测示例。
在最初的15个qPCR循环里， 基线代表的是初始信号，几乎看不出荧光强度的变化。
这种信号可以看作是反应的背景荧光。
循环阈值（Cq）指的是样本荧光信号的强度超过背景信号时对应的循环次数。
Cq值越低，样本中的DNA含量就越高。
来源：RocheCustomBiotech,2017. 通过MagNaPure24或MagNaPure96仪器自动提取DNA，然后在LightCycler480IIReal-TimePCR仪器上进行后续qPCR检测，这是罗氏提供的一个自动化、高通量的支原体检测方案。
如果样本中的细胞密度范围在5×106个细胞/ml左右，则可以用RocheQCPreparationkit进行手动法的核酸制备；如果待处理样本的细胞密度范围在5×106个细胞/ml至1×108个细胞/ml之间，那么可以使用MycoTOOLMycoplasmaDetectionPrepKit,HighCellDensity试剂盒进行核酸制备。
不含细胞的样本可以加入CarrierDNA，以进行有效的核酸抽提，或者在提取和纯化核酸之前加入非干扰性的生物样本。
从样本采集到得出支原体检测结果的整个工作流程需要4-6小时，具体取决于整个检测过程的自动化水平和样本的数量。
整个工作流程如图8所示。
MagNAPure24和96仪器基于磁珠技术，能对来源于多种起始原料（例如全血、血浆、细胞培养物等）的核酸进行纯化。
如需了解更多有关MagNAPure96以及MagNAPure24系统的信息，请浏览下述网页。
(/mag96) (/mag24) 14|技术报告 支原体检测方法概述 手动提取 1ml未处理的样本 自动化系统样本纯化 RocheQCPreparationKit400μlDNA洗脱液 MagNAPure24 MagNAPure96(已有EP验证报告) 200μlDNA洗脱液 MycoTOOL支原体实时荧光定量PCR试剂盒LightCycler480II 4x20μlDNA样本输入 4x20μlDNA样本输入 图8：MycoTOOLqPCR工作流程。
按照手动或自动工作流程，配制细胞密度为5x106个细胞/ml的未处理样本（1ml）。
如果是人工制备样本，则用RocheQCPreparationKit分离核酸。
如果使用自动化核酸分离系统，则选择一款MagNAPure系统纯化样本DNA。
接着，在LightCycler480IIReal-TimePCR系统上进行支原体特异性qPCR反应。
如果采用紫色的自动化工作流程，即使用MagNAPure96和LightCycler480II系统，这个自动化流程满足EP2.6.7.章的要求，并且经过罗氏制药生物技术公司的充分验证。
可以在保密协议的规定范围内按要求提供通用验证报告。
研究设计和结果的相关摘要见/MycoTOOLqPCR来源：RocheCustomBiotech,2017. 为了确保结果的有效性，MycoTOOLqPCR检测方案包含三种对照品。
首先，每个试验都采用了基于质粒的阳性对照品，以便确证整个qPCR流程使用的所有试剂的有效性。
其次，采用H2O为模板作为PCR阴性对照，防止出现假阳性结果。
第三种对照品是基于质粒的回收对照品（RecoveryControl，也被称为外源性内部对照品）；对于各个待测样本，在分离DNA之前将回收对照品加入每一份样本，在核酸抽提完成后，在另 一个PCR反应管中，用另外一套引物和探针（特异性针对回收对照品）进行同步扩增。
RC的作用是证实整个工作流程具有有效性和完整性，包括从DNA分离到PCR的各个环节。
由于RC为加入样本的外源性对照品，所以MycoTOOLqPCR不仅适用于特定的细胞系如CHO，也适用于生物药品生产常用的各种细胞系。
技术报告|15 支原体检测方法概述 对于一个样本的检测，所有扩增反应都要进行重复管扩增（分别采用2份阴性对照品和阳性对照品，4份RC-样本复管检测）。
图9显示的是96孔qPCR反应板的典型布板方案。
123456789101112 ABCDEFGH 支原体预混液：含支原体特异性引物和探针的PCR反应液 回收对照品预混液：含RC质粒特异性引物和探针的PCR反应液 样本 阴性质控品 阳性质控品 图9：MycoTOOLqPCR检测布板方案。
在用MagNAPure24/96仪器进行DNA纯化之前，或在手动提取核酸前，在样本中添加规定浓度的RC质粒。
根据采用的是自动化或手动的核酸纯化方案的不同，1ml样本中抽提纯化获得的DNA最终回收在200μl或400μl洗脱液中。
对样本的支原体检测需进行4管重复，每次使用20μl回收的DNA。
这个样本量相当于原样本体积的40%。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
对于一个样品中是否存在支原体污染，可靠的结果判断必须满足以下质控检测标准：所有阴性对照品的结果均为阴性，阳性对照品以及样本的所有RC反应得到的结果均为阳性。
16|技术报告 监管概述 监管概述 由于支原体污染会对细胞培养产生明显的影响，所以监管部门越来越重视支原体的检测。
如今，全世界几乎所有国家都通过立法对生物制药生产的支原体检测进行管理。
监管部门还通过国家药典中关于支原体检测内容的规定赋予其法律约束力。
这些文件对支原体检测方法以及需要监测的产品进行了相关规定。
但是，不同国家推荐的支原体检测方法以及详细的检测方案各不相同。
总的来说，各国对基于NAT的检测法的使用规定存在较大的区别。
培养法和指示细胞培养法等传统的药典方法（见2.2章）被视为经过长期考验的黄金标准，受到所有药典的一致推荐。
虽然不同国家的药典在具体的方法步骤上存在微小差异，但各个国家推荐的基于培养的检测法都具有大体相似的方案。
表3列举了部分国家的监管机构，以及包含有关支原体检测的监管指南的药典。
监管审批系统卫生部负责对药企开发的医药产品进行科学评估、监督和安全监测。
监管审批部门确保市场上的所有药品都具有安全性和有效性，且质量合格。
人用和动物用药品的审批和上市许可都要求药企必须满足官方规定的质量标准，并通过不同的监管机构和委员会加以控制。
药企必须满足的标准由药典规定和发布。
药典列出了药企必须对药品、中间产物以及原料开展的所有检测，对单个国家或联盟的各个成员国都具有法律约束力。
卫生监管单位 欧洲26 欧洲药品管理局（EMA） UK 药物和保健产品监管机构（MHRA） USA 食品药品管理局（FDA） 日本 日本卫生劳动和福利部 （MHLW） 中国 卫生部（MOH） 巴西 巴西卫生部 阿根廷 阿根廷卫生部 药品审批管理机构 人用药品委员会（CHMP） 由MHRA进行国家审批 由EMA进行集中审批 食品药品管理局（FDA） 药品与医疗器械管理署（PMDA） 中国国家食品药品监督管理局 （CFDA） 国家卫生监督局（ANVISA） 药品管理局（ANMAT） 出版药典 欧洲药品质量管理局（EDQM） 英国药典委员会 美国药典委员会 药品与医疗器械管理署（PMDA） 中国药典委员会（ChPC） 国家卫生监督局（ANVISA） 药品管理局（ANMAT） 药典 欧洲药典（EP）27 英国药典28 美国药典（USP）29 日本药典（JP）30 中国药典（ChP）31 巴西药典32 阿根廷药典33 支原体检测的 NAT认可 ✓ ✓ ✓ ✓ 不明确 没有描述 没有描述 NAT验证要求的✓ ✓ (✓)* ✓** 不明确 ✗ ✗ 相关标准 表3：欧盟、美国、日本、中国、巴西和阿根廷的卫生监管部门概述，包括相应的监管机构、具有法律约束力的文件（药典）、对NAT用于常规支原体检测的接受程度以及NAT验证的质量标准要求。
*USP的表述是“通过程序证实具有可比性”**与EP2.6.7.的内容相同。
技术报告|17 监管概述 快速支原体检测的情况则非常不一样，例如NAT。
虽然很多国家的药典都将NAT描述为一种有效的支原体检测方法，但各国为这种方法制定的方案或验证要求却极少具有一致性。
EP和JP等药典详细描述了有关这种方法的验证指南，但其他国家仅仅只是指出NAT是一种经过验证的有效检测方法。
不过，所有国家都要求对这种检测法进行适当的验证，并与常规支原体检测法进行比较。
与其他所有药典相比，EP2.6.7.章描述的NAT验证指南最为详细。
基于NAT的支原体检测法必须满足四个方面的要求：检测限、特异性、稳健性和可比性（表4）。
为了对NAT方法进行全面的通用验证，建议还要加入精密性和交叉污染等额外的验证参数。
验证要求检测限（LOD） 特异性 稳健性可比性 EP2.6.7.检测限的界定要求必须针对每种支原体确定阳性检测临界值（EP2.6.7.章提供了用作检测的建议支原体种类）。
每种支原体必须至少进行三次独立的10倍梯度稀释液进行检测，且每次检测中每种稀释液浓度都必须制备平行管进行检测，以使各稀释液浓度的检测结果总共能达到24个。
阳性临界值指的是至少能够使95%的试验运行检测得到阳性结果的支原体浓度，即至少要取得23个有效的阳性检测结果。
NAT检测的挑战是要使用对多种支原体都具有适用性和特异性的PCR引物。
往往覆盖的检测种类越多，PCR引物也越可能检测到其他种类的细菌。
例如，革兰氏阳性菌与支原体具有密切的系统进化相关性，PCR可能会检测到这种细菌属，从而产生交叉检测的情况（EP2.6.7.章列举了一系列需要检测交叉反应性的细菌属）。
需要证实NAT检测法是否能够在方法参数发生人为导致的微小变化，或检测方法有所变化时不受影响。
EP2.6.7.章列举了一些变化示例和需要检测的试验方案。
可比性的评估应包含NAT检测法与药典检测法的LOD对比。
本章规定了以下验收标准：1)以NAT法代替培养法：需要证实检测限至少达到≤10CFU/ml。
2)用NAT法代替指示细胞培养法：对每种被测支原体的检测限都必须至少达到≤100CFU/ml。
3)在这两种情况下，采用NAT法的检测和采用常规方法的检测必须同时进行，以便用相同样本（CFU可比性）对它们的LOD进行同步评估。
表4：EP2.6.7对验证要求进行了详细总结。
如需了解更多详细信息，请直接查看EP的NAT支原体检测法验证指南。
还有一些不具备法律约束力的文件也可以为NAT支原体检测法的实施提供参考： (i)美国注射剂协会（PDA）在2010年发表了一篇名为“其他支原体检测方法”的技术报告。
它为快速支原体检测法的新用户提供指导，并描述了非传统培养法的支原体检测法的分析流程、分析验证以及可能用途34。
(ii)罗氏制药用MycoTOOLqPCR检测方案对产品进行放行检测。
该分析的验证按照EP2.6.7章的内容实施，可以在保密协议的规定范围内按要求提供通用验证报告。
研究设计和结果的相关摘要见/MycoTOOLqPCR。
(iii)除了USP以外，FDA相关部门还发布了针对特定主题的指南。
FDA的CBER于1993年发布了一则名为“对生产生物制品使用的细胞系进行特征鉴定时需要考虑的几个问题”（PTC）的指南，又在2010年发布了“行业指南”，为支原体的检测提供了更多信息，但它们均不具备法律约束力35,36。
(iv)《生物分析方法验证》也是FDA发布的一则没有法律约束力的文件，文件内容对其他支原体检测方法的验证进行了最佳实践概述。
37 18|技术报告 验证与实施 罗氏MycoTOOLqPCR检测方案逐步验证和实施 对于MycoTOOLqPCR检测方案在针对特定产品的支原体快速检测和放行中的应用，本章内容对验证和实施这种方法的各个步骤以及需要考虑的时间进度问题进行了概述。
支原体的检测一般包含五个步骤：供应商尽职调查、可行性研究、开发验证方法、开展验证研究以及递交报告。
MycoTOOLqPCR方法对支原体检测的通用性参数已经由罗氏制药进行验证，实施验证期间罗氏可以在签订保密协议的前提下按需提供验证报告，以便节省验证时间和成本。
图13展示的是整个工作流程，下文将对其进行详细叙述。
快速支原体检测法的实施 供应商尽职调查 可行性研究 是否需要使用Roche的验证 报告？ 可行性研究 时间较短时间较长 验证策略 验证策略 验证研究 验证 提交 研究 提交 常规检测 *可以将这种服务外包给CRO，例如图10：MycoTOOLqPCR的实施流程图。
流程图的左侧显示的是利用Roche提供的通用验证报告（对CHO生产流程的验证）实施验证。
将MycoTOOLqPCR用于非CHO流程，或者更改Roche通用验证中使用的方法时，需要重新验证MycoTOOLqPCR方法。
流程图的右侧显示的就是这个流程，这个流程需要的时间比较长。
无论是验证还是常规检测，合约研究机构都可以帮助完成这些检测，如MycoplasmaBiosafety，可以将这个流程中的大多数步骤外包给他们。
来源：Authors，2017。
技术报告|19 验证与实施 供应商尽职调查 这个步骤可能需要花费数日至数月的时间。
涉及对市售的支原体检测试剂盒或对合作开展研究的CRO进行尽职调查。
过程中需要参照监管要求考察商业化检测产品的性能参数和质量标准，并评估支原体检测试剂盒供应商以及CRO的实力。
验证开始之前需要先搞清楚如下这些问题：·供应商有没有为仪器和试剂的设计及生产提供适当的相关 文件？·供应商有没有建立适当的变更控制系统？·供应商能不能按要求提供质量和供应协议？·供应商的交付是否及时可靠？·有没有早期验证研究可供参考？·供应商和CRO是否可以回应审核问卷？是否允许在它们的 检测机构里进行实际审核？·供应商是否为最终用户提供培训计划、现场技术服务、安 装和运行验证服务、预防性维护服务以及技术支持热线？·对于针对特定产品的NAT验证研究以及采用NAT方法的 常规检测，CRO是否有足够的经验可以保证相关工作顺利完成？·CRO是否提供验证报告、详细的检测方案或类似文档？·CRO是否提供技术移交解决方案？ 罗氏制药的通用验证报告罗氏制药按照EP2.6.7.的内容（NAT验证指南）对MycoTOOLqPCR进行了全面的通用验证，验证使用的是特定的仪器（LightCycler®480InstrumentII以及MagNAPure96，见图10），适用于使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的相关流程。
一般来说，只要主要流程（包括仪器）不发生变化，FDA或EMA等监管部门就不会要求用户对MycoTOOLqPCR进行全面的再次验证。
因此，如果采用一致的工作流程开展针对特定产品的验证研究，则验证项目中需要使用的样本较少，时间较短。
不过，作出决定之前必须先与监管部门讨论相关的情况。
根据要求，可签订保密协议，并提供本验证报告。
如需查看包含数据总结的简要报告，请访问以下链接。
(/MycoToolqPCR) 在这个过程中可能还需要进行经济评估或财务评估，以便申请内部预算（例如提供合理的项目计划书）。
由此，必须与合约服务提供商明确一次性费用（实验室场地费用、仪器费用、安装费用等）和运营费用（维护、每份样本的检测费用等）等相关费用的问题。
20|技术报告 验证与实施 可行性研究 这个步骤需要的时间从一周到几个月不等。
开展初期的可行性研究时可以租用仪器设备，或者将研究工作托付给CRO。
可行性研究的作用是在购买仪器以及投入资金开展验证研究之前对相关的概念和检测方案进行技术验证，比如考察MycoTOOLqPCR与待测产品材料之间是否存在任何技术层面的不相容性。
MycoTOOLqPCR的验证是用密度为5x106个细胞/ml的CHO细胞实施的，如果采用其他细胞系或者其他浓度水平，则必须通过检测来确定是否存在产物基质效应（例如，PCR抑制）。
可行性研究的另一个目标是评估LOD是否能达到要求的水平，以及需要对MycoTOOLqPCR检测方案做出怎样的调整才能使LOD达到目标水平。
调整方法可能包括增加PCR反应体积或增加PCR循环次数等。
验证策略 这个步骤需要的时间从一两周到几个月不等。
验证策略的作用是为MycoTOOLqPCR验证研究需要实施的所有试验提供路线图（例如，LOD测试、稳健性测试、特异性分析）。
策略的内容包括时间表、试验计划、试验实施方以及相关的验收标准。
如果采用与Roche的通用验证报告一致的实验流程，则可以将通用验证报告作为验证研究的基础，大大减少需要检测的样本数量，降低研究总体费用。
一般来说，在通用验证报告的基础上，仅需对少数标准进行考察和确认（例如，对指定种类的支原体参考株的LOD）。
但总的来看有一点很重要的是，保持与相关的监管部门的沟通和讨论，确认Roche通用验证报告在整个验证流程中可提供的简化验证的作用。
验证研究 这个步骤需要的时间为两个月到几个月。
验证研究的作用是证明MycoTOOLqPCR能够始终按照监管要求有效地进行支原体检测。
这项研究既可以在内部实验室开展，也可以外包给CRO公司。
CRO会按照验证策略的内容进行试验，并将相关的证据记录在验证报告中。
报告递交与常规检测一旦验证报告递交成功并且通过了监管部门的审批，就可以开展常规检测。
根据客户与项目的具体情况，常规检测既可以交给内部质控专家实施，也可以交给CRO公司开展。
技术报告|21 总结与概述总结与概述 基于NAT的自动化快速支原体检测法为生物医药企业提供了革命性的机遇和竞争优势。
无论是样本制备和支原体检测试剂盒的最新进展，还是以满足监管要求为目标，在针对特定产品的验证方面取得的最新进步，都必然会推动这些新的检测系统逐步取代药典培养法，成为行业内更理想的选择。
从最近的发展和趋势来看，预计EMA和美国FDA等监管部门会在未来几年之内逐步批准将NAT快速检测法用于生物制药企业的常规支原体检测。
对于将罗氏MycoTOOLqPCR检测方案作为一种基于NAT的快速自动化支原体检测法用于生物制药产品的过程控制和批次放行，本指南对怎样验证和实施这种检测方案进行了特点概述，并提供了具体的建议。
目前，MycoTOOLqPCR的用户都非常认可这种高度自动化的分析方案。
该方案的优势包括操作简单，工作流程短，当天就能给出结果，对样本进行高通量处理，成本效益高，即使在高细胞密度的“最坏情况”下也不会产生基质干扰效应和PCR抑制效应，此外还可以检测不含细胞的样本。
这种自动化支原体检测系统的通用性验证设计和报告，将大大简化各种生物制药产品的产品特异性放行验证方案。
MycoTOOLqPCR可以用作原料检测、过程控制和最终批次放行的早期报警系统，以便可靠地消除生产过程中存在的支原体污染风险，提高生产效率和产品质量。
与药典记载的培养法相比，基于NAT的自动化MycoTOOLqPCR检测法具有明显的优势，而且可以从合约服务实验室的经验丰富的专家处获取针对特定产品的定制验证方案，因此预计这种方法将来会越来越多地被用于常规支原体检测，也将影响到整个生物制药产业的质控和批放行标准，以及未来的行业发展。
22|技术报告 附录 试剂盒MycoTOOLMycoplasmaReal-TimePCRKitMycoTOOLPCRMycoplasmaDetectionKit QCSamplePreparationKit ResidualDNAE.coliKitResidualDNACHOKit 试剂盒MagNAPure96Instrument MagNAPure24Instrument LightCycler®480InstrumentII 参考标准支原体培养基参考标准品 包装大小1个试剂盒(160次PCR反应) 1个试剂盒 物料号06495605001 05184240001 1个试剂盒 08146829001 1个试剂盒(96次反应)1个试剂盒(96次反应) 0772873500107427689001 说明 用于检测细胞培养物样本中是否存的支原体污染。
MycoTOOL实时PCR试剂盒让支原体检测变得快速、简单和可靠。
用于检测细胞培养物样本中是否存的支原体污染。
MycoTOOLPCR试剂盒让支原体检测变得快速、简单和可靠。
该试剂盒的用途是对核酸进行人工提取和纯化，将处理过的核酸与MycoTOOLMycoplasmaReal-TimePCRKit或MycoTOOLPCRMycoplasmaDetectionAmplificationKit配合使用。
这款试剂盒所包含的方案，适用于正常细胞密度与高细胞密度的细胞培养物样本。
另外，它还可以和ResidualDNACHO试剂盒与ResidualDNAE.coli试剂盒配合使用。
用于检测细胞培养物样本中是否含有大肠杆菌产生的残留宿主细菌DNA。
用于检测细胞培养物样本中是否含有CHO细胞产生的残留宿主细胞DNA。
包装大小1台仪器，控制单元和配件 1台仪器，内置控制单元和配件 1台仪器(96反应模块) 物料号06541089001 07290519001 05015278001 说明高通量工作站，适用于核酸的全自动纯化处理，可以处理多达96个样本。
高通量工作站，适用于核酸的全自动纯化处理，可以处理多达24个样本。
速度快，高通量、基于平板的实时PCR扩增和检测仪器。
物料号mbsCRS-EP10* mbsCRS-JP7* 说明 涵盖EP2.6.7.提到的各种支原体株的全套产品：莱氏衣原体(A.laidlawii)PG8T，精氨酸支原体(M.arginini)G230T，发酵支原体(M.fermentans)PG18T，猪鼻支原体(M.hyorhinis)BTS7T，口腔支原体(M.orale)CH19299T，肺炎支原体(M.pneumoniae)FHT，鸡毒支原体(M.gallisepticum)PG31T，关节液支原体(M.synoviae)WVU1853T，柠檬螺原体(S.citri)R8A2T以及猪鼻支原体(M.hyorhinis)DBS1050α-亚型。
涵盖JP第17版提到的7种支原体株的全套产品：莱氏衣原体(A.laidlawii)PG8T，精氨酸支原体(M.arginini)G230T，发酵支原体(M.fermentans)PG18T，猪鼻支原体(M.hyorhinis)BTS7T，口腔支原体(M.orale)CH19299T，肺炎支原体(M.pneumoniae)FHT，以及关节液支原体(M.synoviae)PG20T。
*EMA和FDA批准可用于NAT法验证的低GC/CFU支原体参考标准品。
浓度分为10、100和1000CFU/100μl，有活株原液、热灭活原液或裂解原液可供选择。
技术报告|23 术语表 术语表 缩写ADPANMATANVISAATPCBERCDERCFUCHOChPChPCCqCROCFDACVMDNAdsDNAEDQMELISAEMAEPEUFDAG+CGMP 定义二磷酸腺苷药品管理局（阿根廷）国家卫生监督局（巴西）三磷酸腺苷生物制品评价和研究中心（USFDA）药品评价和研究中心（美国食品药品监督管理局）集落形成单位中国仓鼠卵巢（细胞）中国药典中国药典委员会循环阈值合同研究机构中国（国家）食品药品监督管理局兽医医学中心（美国FDA）脱氧核糖核酸双链DNA欧洲药品质量管理局酶联免疫吸附测定法欧洲药品管理局欧洲药典欧盟美国食品药品管理局鸟嘌呤-胞嘧啶含量良好生产规范 24|技术报告 术语表 缩写HEKICHJPLODMHLWMHRAMOHMycoTOOLqPCRNATPBSPCRPDAPMDAPTCQCqPCRRCRNASCssDNATD-PCRUKUSUSP 定义人胚肾国际协调委员会日本药典检测限日本卫生劳动和福利部药物和保健产品监管机构（UK）中国卫生部MycoTOOL支原体实时荧光定量PCR试剂盒核酸扩增技术磷酸缓冲盐溶液聚合酶链反应注射剂协会药品与医疗器械管理署FDA/CBER指南1993-PointstoConsider质量控制实时定量PCR回收质控DNA核糖核酸小菌落型单链DNA降落PCR(TouchdownPCR)英国美国美国药典 技术报告|25 参考文献 参考文献 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技术报告|27 RegulatoryDisclaimerForfurtherprocessingonly. 仅用于进一步加工处理使用。
不可直接用于体外诊断程序。
MYCOTOOL是属于罗氏的商标。
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支原体几乎能够影响细胞培养的每一个参数，并且通常仅产生微小的可见变化，对于制药产业来说，它们是一种无法掌控的、可造成潜在损害的因素。
因此，监管部门要求制造商检测自己生产的生物制品，确保被放行出厂的产品中都不含支原体。
全球大多数药物监管部门都发布了提供支原体检测方案的相关指南，有些还对快速NAT（核酸扩增技术）检测方法的验证提出了一些建议。
但这些有关快速支原体检测的建议并不一致，导致这类检测对于药企而言成为一项挑战。
2018年1月 SebastianMachadoWeber,Dr.AndreasRohwer,AlexanderBartes,ChristinaKrause,RaphaelGreinerRocheCustomBiotechDr.Carl-UlrichZimmermann,Dr.MartinaSauert,MartinVronka,Dr.SandraBuczolits,Prof.Dr.RenateRosengartenMycoplasmaBiosafetyServicesGmbH 前言 RocheCustomBiotechMycoTOOL支原体实时PCR分析试剂盒（MycoTOOLqPCR–/mycotool）联合手动抽提试剂盒QCSamplePreparationKit，或RocheMagNAPure96/MagNAPure24样本制备系统可进行高效的生物制品支原体检测。
这种基于NAT的方法具有可自动化和速度快的优点，本文的目的在于为NAT快速支原体检测方法的验证和实施提供指导和建议。
章节概览
1.对支原体进行简单地介绍。
此外，还讨论了生物制品生产中和支原体污染相关的过程。
2.对当前用于支原体检测的药典方法和非药典方法进行了介绍和举例描述。
其中，对药典规定的培养法和指示细胞培养法，以及基于NAT的快速检测法进行了详细的介绍。
3.讨论了在支原体快速检测法的应用过程中需要考虑的监管方面的问题。
并讨论了欧洲药典（EP2.6.7.）
1、美国药典（USP<63>）2和日本药典（JP第17版）3等监管指南。
4.针对特定产品的NAT快速检测方案验证和项目的方案设计进行说明，并为每个步骤提供了相关建议。
这一章的内容涉及到一套完整流程的各个相关步骤，从供应商调查，到开展可行性和验证研究，再到日常检测的实施都被纳入其中。
5.最后一章的总结与概述描述了基于NAT的快速支原体检测法的长期应用前景。
并讨论了将这种快速方法应用在早期报警系统和批放行检测中的竞争优势，以及这些替代检测系统能够为生物制药产业带来的新机遇和受益。
关于我们 借助罗氏诊断和罗氏制药的专业技术，CustomBiotech为您的生物制药、细胞治疗或体外诊断业务提供高质量的原料、仪器和服务，全面满足您独特的质量和管理需求。
了解更多信息：(/custombiotech) MycoplasmaBiosafety是一家合约研究机构和服务提供商，专业致力于为生物制药产品开发满足GMP规定的支原体检测方法，同时也是行业内支原体学科的技术引领者。
借助于传统的培养方法和新型的快速PCR分析法，MycoplasmaBiosafety能够提供全面的支原体检测服务——支原体检测与检测方法验证开发，生产支原体培养基以及参考标准品。
了解更多信息(/mbs) 2|技术报告 目录 目录 引言�����������������������������4细胞培养中的支原体����������������������5生物药品生产过程中的支原体������������������6支原体检测方法概述����������������������8非药典检测法�������������������������8药典检测法��������������������������9基于NAT的方法�����������������������13监管概述��������������������������17罗氏MycoTOOLqPCR检测方案的逐步验证和实施���������19总结与概述�������������������������22附录����������������������������23术语表���������������������������24参考文献��������������������������26 技术报告|
3 引言 引言 “支原体”通常被用作柔膜细菌类中所有细菌的惯用名（在古英语中，mollis=“软”,cutis=“皮肤”）（图1）。
柔膜细菌的特点是没有细胞壁，基因组规模小（0.5–2.2兆碱基对），且GC（鸟嘌呤-胞嘧啶）含量低（20–40mol%）。
由于基因组较小，支原体具有宿主依赖性，需要在人类及其他脊椎动物、植物和昆虫等多种宿主的体内或体表作为共生物或病原体存活。
这种微生物在有氧或缺氧条件下都可以增殖。
它们都具有多晶细胞形态学(螺原体除外，这种支原体属具有螺旋式结构)，还有些支原体（Mycoplasmagallisepticum,Mycoplasmapneumoniae）有突出的终端，形状类似于烧瓶。
根据种类的不同，支原体可以在液体培养基中以单细胞（Mycoplasmaarthritidis）或聚合物（Acholeplasmalaidlawii,Mycoplasmapneumoniae,Mycoplasmafermentans）的形式生长
4。
由于没有细胞壁，所以支原体对青霉素等以细胞壁作为靶点的抗生素具有抵抗性。
此外，液体培养基中的支原体还可以在固体表面形成生物膜，比如玻璃或塑料表面等，由此产生另一种抵抗水平，也就是对消毒剂和环境应力条件的抵抗
5。
第一种支原体于1896年在InstitutePasteur培养成功，它是从患有胸膜肺炎的牛体内分离出来的，后来被称为丝状支原体丝状亚种/小菌落型（Mycoplasmamycoidessubsp.mycoidesSC）
6。
纲 目 枝原体目 科 支原体科 甾原体甾原体科 柔膜细菌虫原体目 螺原体科 虫原体科 厌氧原体目厌氧原体科 属支原体属*脲原体属* 甾原体属* 螺原体属 虫原体属 图1：柔膜细菌类。
用紫框标注的微生物属与生物制药产品的生产过程具有相关性。
*该属含有普遍存在于人类中的支原体。
来源：Authors，2017。
中间原体属 厌氧原体属 无甾醇原体属 由于基因组较小，所以支原体完全缺乏或部分缺乏几种常见 的代谢途径，必须从环境中获取必要的营养物（氨基酸、核苷碱基和脂肪酸），以寄生方式生存
7。
长期以来，支原体的病原体特性一直被人们低估。
出于这个原因，也没有开发出适用的分子诊断方法。
不过近年来的情况发生了很大的改变，支原体培养技术和分子检测技术的进展快速，并得到了越来越广泛的接受和应用
8。
4|技术报告 引言 细胞培养中的支原体除了在临床检测中的意义获得不断提高，支原体对细胞培养的影响也已经得到了极大的关注。
它们天然寄存于植物和动物的组织里，而各种细胞培养基都含有来源于植物或动物的补充剂。
同时支原体的体积很小，平均只有0.1–0.8μm（图2），由于没有细胞壁且形状可变，所以支原体很容易通过标准灭菌过滤器，和培养基或原料添加剂一起进入细胞培养过程。
最常见的两个污染源是实验室人员和已经受到污染的细胞培养物，这些污染物通过交叉污染作用在生产过程中继续传递
9。
由于支原体在标准光学显微镜设置下是不可见的，而且通常不会使细胞培养物的状态发生明显变化，所以一般很难观察到污染的发生。
然而，它们的存在却会影响细胞的生长和代谢，进而对宿主细胞表达的治疗性蛋白产生影响。
生物药生物制药产品（也被称为生物制品）是生产和提取自细菌、酵母、哺乳动物细胞系或哺乳动物等生物来源的医药产品。
疫苗、血液成分、重组蛋白、基因治疗、组织以及用于治疗的细胞都属于这个类别。
它们含有核酸、蛋白、糖以及由这些物质构成的复合物，与人体内天然存在的分子完全相同或者具有相似性。
与化学合成药物（通常指的是小分子）不同，生物制品的分子量要大得多，通常是小分子药物的100倍以上。
用哺乳动物细胞系进行生物制药生产通常使用基因工程技术开发出表达生物大分子的真核细胞系（如CHO或HEK293），然后进行收获、纯化和制剂。
如图3所示。
由于生产流程十分复杂，所以生物制药产品的生产和产品放行都面临着独特的挑战。
首先，细胞系可能会被支原体污染，因此批放行之前需要先进行支原体检测。
其次，由于生物制品采用过滤法除菌，所以存在支原体或病毒穿过滤膜的潜在风险。
第
三，污染物可能会通过原料进入细胞培养物。
正因为如此，支原体检测尤其是早期报警系统（也称为过程控制）是十分必要的质量控制技术，以期尽快尽早地发现污染物。
支原体细胞(0.1-0.8μm) 病毒(0.05-0.1μm) 酵母细胞(3-10μm) 细菌细胞(1-10μm) 真核细胞(10-100μm) 电子显微镜 0.1μm光学显微镜 1μm 10μm 100μm肉眼 图2：不同微生物的相对大小。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
技术报告|
5 引言 尽管理解支原体污染可能造成的生产损失和质量影响、尽管明白支原体污染的检测是十分必要的过程质控环节，但在实际生产过程中仍然少有公司对细胞培养物进行监测。
研究发现，在全球范围内的可用细胞系中，其污染率大约是5–35%10,11,12。
对于防止细胞培养物被支原体污染的目标而言，只有定期检测支原体才是最具有实践性和防范作用的手段。
在生产流程中，只有严格的常规性支原体检测才能预防隐蔽的支原体污染，将它们造成严重后果的风险降到最低13。
由于相关的检测方法以及对检测结果的解释都需要通过培训和不断地积累经验才能掌握，所以支原体检测通常无法在生产商内部有效进行。
将支原体的检测工作托付给经验丰富、值得信任的合同合作伙伴具有很多优势。
首先，这种做法可以在尽可能短的时间内取得有效的检测结果。
其次，不需要建立和维持内部检测部门，从而将更多的资源应用在核心业务上。
最后一个极为重要的优势在于，可以避免因为引入阳性对照品而导致支原体污染的潜在风险。
生物药品生产过程中的支原体 在生物制药行业，支原体污染产生的影响几乎具有毁灭性，例如整批产物都必须丢弃，生产车间也必须停产整顿14。
国际监管机构发布的指南已经阐明，为了确保产品的安全性、纯度和产品效力，生物制药产品中不能存在支原体污染。
因此，为了确保整个生产流程的平稳，必须尽早实施支原体检测。
图3显示的是常见的检测点。
人们根据这些不同的检测点开发了多种支原体检测方法，后文将对它们进行讨论。
细胞治疗前沿治疗性药物（Advancedtherapymedicinalproducts,ATMP）是一类以基因（基因治疗）、体细胞（细胞治疗）或组织（组织工程）为基础的新型治疗药物。
这些前沿药物为多种疾病提供了新的治疗方法，它们将为患者带来巨大的福音。
细胞治疗通常需要从患者身上分离细胞，然后进行体外细胞培养，再将细胞注入患者体内。
与大分子生物制品相比，细胞治疗产品的生产和放行还面临着其他挑战。
首先，其中大部分药物根本无法灭菌。
其次，细胞治疗药物的有效期通常很短，需要立即注入患者体内。
第
三，这种药物的批产量通常只有一倍剂量率，量非常少。
在这种情况下，支原体快速检测法比常规支原体检测法更受欢迎，因为前者所需的检测样品量相对较少，且对生产批次的放行速度快于常规支原体检测法。
6|技术报告 引言 原材料 缓冲液制备 细胞培养液 种子培养 发酵+澄清 收获 纯化 制剂 行业要求 必要检测点 推荐的生产过程控制点 监管部门要求 图3：生物制药生产过程中的支原体污染检测点。
原料的污染物检测结束之后（灰色圈），加入缓冲液或培养基开始进行细胞培养，此时也需要进行污染检测（蓝色圈），因为支原体可能会通过细胞系或实验室人员进入生产流程。
建议在种子培养和实际发酵过程中开展生产过程控制（淡紫色圈）。
发酵结束时还要进行最后一次检测，这也是监管部门要求开展检测的一个时间点（紫色圈）。
在证实了收获液中不含支原体以后，由于产品的纯化处理是在不含活性微生物的条件下进行的，所以通常不需要再实施检测。
来源：RocheCustomBiotech,2017. 在细胞培养或生物制药生产的过程中，经常或可能会出现、并且被视为主要污染种属的支原体如表1所示。
对于生产过程来说，支原体污染产生的影响不仅会导致产品质量下降， 还会降低表达水平并由此降低产量。
质量不佳和支原体污染的生物制品可能致使患者产生严重的副作用15,16。
MycoplasmaspeciesAcholeplasmalaidlawii 主要来源（与使用以下来源的原料生产出来的产品相关） 牛、猪、禽类、植物 已发表报告提到的常见细胞培养污染物 是 Mycoplasmaarginini 牛，绵羊，山羊，猪 是 Mycoplasmabovis 牛 是 Mycoplasmafermentans 人 是 Mycoplasmagallisepticum 禽类 否 Mycoplasmahyorhinis 猪 是 Mycoplasmaorale 人 是 Mycoplasmasalivarium 人 是 Mycoplasmasynoviae 禽类 否 Spiroplasmacitri 植物 否 表1：在细胞培养和生物制药过程中经常、偶尔或可能会检测到的支原体种类。
潜在污染源 其他细胞系，牛血清，营养肉汤粉末 其他细胞系，牛血清其他细胞系，牛血清其他细胞系，人其他细胞系，鸡胚其他细胞系，猪胰蛋白酶其他细胞系，人其他细胞系，人其他细胞系，鸡胚其他细胞系 技术报告|
7 支原体检测方法概述 支原体检测方法概述 支原体的检测对于细胞培养过程和生物制药的质量控制而言是一项挑战，因为只有具备专业技能和丰富经验的工作人员才能发现它们，尤其是低水平的污染更是如此。
在最近十年里，有两种经典的方法被用于常规支原体检测，它们的灵敏度和可靠性已经获得了证实：（i）培养法（也被称为琼脂肉汤法），（ii）指示细胞培养法。
有些基于酶或免疫学的非药典分析法具有速度快和容易实施的优点，但它们的灵敏度都不如培养法。
因此，药典专论认为这些检测方法不能替代常规检测。
在过去几年里，对速度快、灵敏度高且稳健性高的支原体检测法的需求迫切性日益增加，因为经典培养法的所需时间过长， 可能会耽搁产品的放行，并由此产生高昂的费用。
EP指南指出，如果NAT检测方案的灵敏度能达到与经典培养法相同的水平，并且具有良好的稳健性和特异性，则可以用NAT作为支原体检测方案替代经典培养法。
本章对用于支原体检测的非药典方法和药典方法进行了概述。
并介绍了NAT方法及罗氏MycoTOOLqPCR检测方案。
罗氏MycoTOOLqPCR检测方案已经通过了EP支原体NAT验证指南规定的所有的必要相关标准，可以替代指示细胞培养法和培养法。
非药典检测法用于检测支原体的非药典方法通常灵敏度较低，无法在监管要求的支原体污染水平下限进行检测。
如果支原体污染的水平较低，检测的结果有时候还会难以解释。
这些检测较易产生假阴性结果。
直接DNA染色用DNA（脱氧核糖核酸）特异性荧光染料对细胞培养物直接染色并进行观察，但不建议将该方法用于检测支原体污染。
这种检测方法能可靠地检测重度污染培养物，但该方法很难判定被支原体轻度污染的培养物，因为细胞培养物的DNA也可能会产生荧光小点，与支原体具有相似性17。
基于酶的检测方法基于酶的分析方法是一种具有选择性的生化检测，其检测原理在于利用了支原体酶的活性。
将这种方法用于常规支原体检测的前提条件是被检测的酶仅在各种支原体中广泛存在 并具有活性，而不存在于真核细胞基质中。
比如基于荧光素酶的支原体检测分析18,19，虽然这种方法具有速度快（<20min）、操作相对容易（两个发光读数）、结果容易解释的特点，但它们的检测限都达不到药典要求的水平[<10CFU（集落形成单位）/ml]。
大多数支原体都可以在104-105CFU/ml的滴度范围内被检测出来20。
PCR-ELISA检测MycoplasmaPCR-ELISA检测方法是一种将细胞培养物中支原体DNA进行PCR扩增后与ELISA（酶联免疫吸附测定法）相结合的分析法21。
在PCR反应过程中，用地高辛标记的核苷酸被整合到扩增子里，能够在ELISA分析中被检测出来。
有文献表明对于特定种类的支原体（如M.fermentans和A.laidlawii），PCR-ELISA检测的灵敏度水平可以达到1-3个支原体“微粒”22。
但是，这种方法对其他支原体的检测限（LOD）是每mL样本1000个支原体“微粒”，无法达到EP监管指南的相关要求。
8|技术报告 支原体检测方法概述 药典检测法药典中提及的支原体检测方法涉及了使用液体培养基和固体琼脂培养基的经典微生物培养法，以及采用了分子技术的快速检测方法。
这些方法的摘要见本章内容和表
2。
方法培养法 优势 灵敏度可达到0.1CFU/ml的检测限 劣势 培养期长达28天使用多种培养基对不同的支原体种类进行检测标准支原体培养基检测不到难培养的M.hyorhiniscultivaralphastrains 指示细胞培养法 成本较低 培养期长达7天灵敏度较低 基于NAT的方法 灵敏度至少达到<10CFU/ml的检测限快速 检测结果的可靠性高度依赖于样本制备和DNA提取的质量和效率需要DNA提取试剂盒与核酸扩增和检测设备/仪器需要验证与培养法和指示细胞法可比性 表2：药典支原体检测方法的优点与缺点。
培养法在当代分子检测技术出现之前，传统的培养方法一直是微生物检测的金标准，至今为止，全球范围内仍将它作为支原体常规检测方案和药典方案（EP、USP和JP监管指南都包含这种方法）。
培养法以支原体的定向培养为基础，使用能够促进支原体生长的培养基。
将需要检测的样本接种到支原体的液体培养基和琼脂上，在温度为36±1°
C、CO2含量为5.5±0.5%、O2含量为3±1%、相对湿度为90±5%的微氧条件下培养，以促进支原体生长。
到了初次接种后的第21天，将 液体培养基的传代培养物接种到琼脂平板上。
支原体会在琼脂培养基上形成微小的集落（直径<100–400μm）。
支原体集落的形态具有多样性，既有典型的煎蛋形，也有较不规则的形状（图4）。
支原体集落可能非常小，在显微镜下统计和判断菌落的工作要求实验室工作人员具备相关的经验。
图5是培养法的示意图。
技术报告|
9 支原体检测方法概述 图4：在不同支原体琼脂培养基上生长的各种支原体形成的集落以及参照野生株。
来源：MycoplasmaBiosafetyServicesGmbH,Dr.Carl-UlrichZimmerman,2016 由于培养法所需的样本体积相对较大（10ml），培养期较长（一共28天），所以培养法是灵敏度最高的检测方法之
一，其检测限的理论值和实测值都达到0.1CFU/ml，即1CFU/10ml样本。
这种方法满足EP2.6.7提出的能够在10CFU/ml的支原体污染水平进行检测的要求，因此目前仍然被全球各国列在监管文件中用作参照方法。
但培养法有一些不足之处，其中最主要 的问题是培养期长达28天。
这么长的培养期会给很多药物生产商带来严重的困扰，比如产品放行被推迟，产生高昂的储存费用，检测原料、细胞系以及上下游处理的过程控制涉及的大量物流工作，以及由此产生的高昂人工费用等。
培养法的另一个局限性在于需要使用几种不同的生长培养基，因为并非所有类型的支原体都能在同一种培养基里存活。
由此，根据样本来源 10|技术报告 支原体检测方法概述 0.2ml阴性质控品>14天 集落计数 样本 10mlin 100ml 0.2ml 阴性质控品 0.2ml 阳性质控品 0.2ml day2-4day6-8day13-15day19-21 集落计数 图5：MycoplasmaBiosafety按照EP2.6.7.的要求实施的培养法检测示意图。
取200μl待测样本涂布固体支原体生长培养基上，再取10ml待测样本接种到100ml液体生长培养基中，检测是否存在支原体污染。
以没有接种的培养基作为阴性对照品，接种量≤100CFU的培养基作为阳性对照品。
将液体培养基培养20–21天。
在接种后第2–4天、6–8天、13–15天和19–21天，取200μl样本接种的培养基以及阴性对照品和阳性对照品涂布在琼脂培养基上。
接种后的琼脂培养基至少要培养14天，但对应于20-21天传代培养的培养基除外，它们的培养时间为7天。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
的不同，需要同时使用不同的支原体培养基，以扩大可检测的支原体种类范围。
出于这个原因，EP2.6.7.建议至少使用两种标准支原体培养基：用于检测非禽类支原体的FRIIS培养基和用于检测禽类支原体M.synoviae的FREY培养基。
而培养法最大的局限性可能在于部分支原体菌株的高度苛养性，例如猪鼻支原体M.hyorhiniscultivaralphastrains（以M.hyorhinisDBS1050 作为参照株）等，由于蛋白胨和酵母产物对其具有生长抑制作用，导致它们不能在标准培养基里生长23。
这些细胞培养基适应性菌株的生长情况取决于其各自细胞培养的生境。
为了检测M.hyorhiniscultivaralphastrains，需要用到指示细胞培养法。
技术报告|11 支原体检测方法概述 指示细胞培养法指示细胞培养法通常以Vero或3T3细胞系进行检测，但EP监管指南也允许使用具有相同效果的生产细胞系检测支原体。
用样本接种指示细胞培养基之后，在35–38℃的温度下培养，直至细胞汇合。
对于阳性对照品，也可以在存在或不存在被测样本的条件下，用M.orale和M.hyorhiniscultivaralphareferencestrain接种指示细胞系。
染色前，先用固定液将传代 培养物固定，再用能够与DNA结合的荧光染料染色。
支原体存在的特征是细胞表面的荧光模式呈球形，且周围区域散发出强烈荧光。
细胞质中的线粒体也会被染色，但很容易就能将它们与支原体区分开来。
如果阳性对照品没有呈现出典型的支原体荧光模式，或者阴性对照品呈现出典型的支原体荧光模式，则检测无效。
图6是指示培养法的示意图。
阳性质控品 阳性质控品 1ml 1ml样本 1ml样本 + 样本 口腔支 猪鼻 原体 支原体 ≤100CFU≤100CFU 阳性质控品 口腔支原体≤100CFU 10ml 荧光显微镜镜检 阳性质控品 猪鼻支原体≤100CFU 阴性质控品 阳性质控品：Vero细胞+猪鼻支原体 阴性质控品：Vero细胞 图6：MycoplasmaBiosafety实施的指示细胞培养法检测。
在新鲜制备的Vero指示细胞培养物中接种1ml待测样本。
准备四份阳性对照品。
两份阳性对照品含有用1ml样本接种的Vero细胞，并分别接种不超过100CFU的猪鼻支原体和口腔支原体。
另外两份阳性对照品则是不含样本、用不超过100CFU的猪鼻支原体和口腔支原体接种的Vero细胞。
取后者的这两份阳性对照品涂布在琼脂培养基上，检查支原体活力。
阴性对照品为未接种样品和阳性支原体的新鲜制备Vero细胞。
所有细胞培养物放在CO2恒温箱中培养，直至达到100%的细胞汇合度为止。
然后用缓冲液冲洗细胞层并进行胰酶处理。
将脱落的细胞重新悬浮于细胞培养基里，转移至腔室培养玻片，在CO2恒温箱里培养，直到细胞密度达到约50%为止。
用新制固定液将细胞层固定两次，然后风干，用Hoechst染色法染色后用荧光显微镜进行观察分析。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
12|技术报告 支原体检测方法概述 培养法和指示细胞培养法都需要很长的时间才能得出结果（培养法需要28天，指示细胞培养法需要7天），同时由于引入了阳性对照品或可能的支原体阳性样本，所以这些方法本身就存在导致设备发生支原体污染的风险。
基于NAT的方法在基于NAT的方法学中，所有试验都以核酸检测为基础。
通常采用PCR技术来进行核酸检测。
PCRPCR是一种可用于多个领域的分子生物学方法，包括食品和环境分析、法医学以及医学诊断等。
其原理是对DNA进行特异性的扩增处理，使之达到可以检测的水平。
扩增时使用DNA聚合酶，用热循环仪进行多个周期的自动化扩增处理。
每个扩增周期都包括三个主要步骤： 为了开发出灵敏度高、特异性好或者所需时间更短的PCR分析法，需要对PCR温度方案进行优化。
例如，降落PCR（TD-PCR）就是一种很常用的方法，它可以提高PCR分析目标基因的特异性。
TD-PCR中引物在最开始的几个PCR循环中可以在较高的退火温度下与目标DNA序列发生具有高度特异性的结合，从而确保只有特定的DNA序列得到扩增。
然后逐渐降低退火温度，使PCR效率达到最高水平。
TD-PCR方案可以减少非特异性DNA的合成24。
MycoTOOLqPCR通过TD-PCR技术实现具有高度特异性的支原体检测。
1.加热使双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA)。
2.让PCR引物与特定的ssDNA位点（例如，特定的目标基因）相结合。
3.以退火结合的引物序列为起始点，DNA聚合酶按照ssDNA的序列进行延伸，合成互补的DNA序列。
如需了解关于常规PCR发展为qPCR的历史、技术进展情况和其他更多信息，请访问： 如需了解更多信息，请查看详细的PCR流程： （/dnacopy） 一般而言，经过30–50个PCR周期的扩增处理后，所得到的特异性DNA扩增子足以用荧光染料染色，进行凝胶电泳分析，或用其他方法对荧光信号进行检测。
（/storypcr） 相比于普通PCR，实时PCR（qPCR）能够实时报告DNA的扩增情况。
因此，实时PCR不需要在PCR处理后用凝胶电泳等方法检测DNA，大幅降低了在实验室里发生污染的风险，并且有助于对最终结果进行解释。
实时PCR使用的探针含有与短DNA序列（18-30个碱基对）相连接的荧光染料。
这种探针在PCR的每个扩增循环中都会被纳入新合成的DNA互补链。
市场上有多种不同的探针设计可供选择，其中最常见的探针之一就是MycoTOOLqPCR使用的水解探针。
在每个PCR循环结束后，这种探针都会以荧光强度的形式报告DNA的总量。
随着目标序列的不断扩增，荧光信号的强度也会成比例地升高。
将荧光强度与PCR循环数对应作图，就可以得到一条典型的S状qPCR曲线（见图7）。
技术报告|13 支原体检测方法概述 PCR和qPCR的检测灵敏度都很高，如有DNA污染的发生，则容易造成假阳性的报告结果。
最常见的污染源是DNA模板自身，以及PCR反应结束后产生的DNA扩增产物。
DNA分子可以通过空调系统或实验室人员在实验室里传播。
消除这些污染源最有效的方法是在单独的工作区域或单独的房间里，以单向工作流的方式完成从采样、样本处理、反应液配置直至PCR扩增和PCR产物检测的工作流程25。
MycoTOOLMycoplasmaReal-TimePCR试剂盒(MycoTOOLqPCR) MycoTOOLReal-TimePCR试剂盒是一种qPCR分析法，特别适用于细胞培养物的支原体检测。
它完全满足EP2.6.7.对NAT支原体检测法提出的有关灵敏度（例如，检测限≤10CFU）、特异性、稳健性以及一致性的要求。
并且不需要进行支原体富集或预培养处理。
该试剂盒使用的引物和探针对支原体16S核糖体DNA基因具有高度特异性，能够检测150多种可以培养以及不可培养的支原体，包括细胞培养物中的常见支原体污染物种类以及可能会出现的污染种类，如莱氏衣原体、精氨酸支原体、发酵支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、唾液支原体、关节液支原体以及柠檬螺原体（表1），还有肺炎支原体和人型支原体等致病性人支原体。
ΔRn 54.61749.61744.61739.61734.61729.61724.61719.61714.617 9.61794.6170.383 51015202530354045循环 图7：MycoTOOLqPCR支原体检测示例。
在最初的15个qPCR循环里， 基线代表的是初始信号，几乎看不出荧光强度的变化。
这种信号可以看作是反应的背景荧光。
循环阈值（Cq）指的是样本荧光信号的强度超过背景信号时对应的循环次数。
Cq值越低，样本中的DNA含量就越高。
来源：RocheCustomBiotech,2017. 通过MagNaPure24或MagNaPure96仪器自动提取DNA，然后在LightCycler480IIReal-TimePCR仪器上进行后续qPCR检测，这是罗氏提供的一个自动化、高通量的支原体检测方案。
如果样本中的细胞密度范围在5×106个细胞/ml左右，则可以用RocheQCPreparationkit进行手动法的核酸制备；如果待处理样本的细胞密度范围在5×106个细胞/ml至1×108个细胞/ml之间，那么可以使用MycoTOOLMycoplasmaDetectionPrepKit,HighCellDensity试剂盒进行核酸制备。
不含细胞的样本可以加入CarrierDNA，以进行有效的核酸抽提，或者在提取和纯化核酸之前加入非干扰性的生物样本。
从样本采集到得出支原体检测结果的整个工作流程需要4-6小时，具体取决于整个检测过程的自动化水平和样本的数量。
整个工作流程如图8所示。
MagNAPure24和96仪器基于磁珠技术，能对来源于多种起始原料（例如全血、血浆、细胞培养物等）的核酸进行纯化。
如需了解更多有关MagNAPure96以及MagNAPure24系统的信息，请浏览下述网页。
(/mag96) (/mag24) 14|技术报告 支原体检测方法概述 手动提取 1ml未处理的样本 自动化系统样本纯化 RocheQCPreparationKit400μlDNA洗脱液 MagNAPure24 MagNAPure96(已有EP验证报告) 200μlDNA洗脱液 MycoTOOL支原体实时荧光定量PCR试剂盒LightCycler480II 4x20μlDNA样本输入 4x20μlDNA样本输入 图8：MycoTOOLqPCR工作流程。
按照手动或自动工作流程，配制细胞密度为5x106个细胞/ml的未处理样本（1ml）。
如果是人工制备样本，则用RocheQCPreparationKit分离核酸。
如果使用自动化核酸分离系统，则选择一款MagNAPure系统纯化样本DNA。
接着，在LightCycler480IIReal-TimePCR系统上进行支原体特异性qPCR反应。
如果采用紫色的自动化工作流程，即使用MagNAPure96和LightCycler480II系统，这个自动化流程满足EP2.6.7.章的要求，并且经过罗氏制药生物技术公司的充分验证。
可以在保密协议的规定范围内按要求提供通用验证报告。
研究设计和结果的相关摘要见/MycoTOOLqPCR来源：RocheCustomBiotech,2017. 为了确保结果的有效性，MycoTOOLqPCR检测方案包含三种对照品。
首先，每个试验都采用了基于质粒的阳性对照品，以便确证整个qPCR流程使用的所有试剂的有效性。
其次，采用H2O为模板作为PCR阴性对照，防止出现假阳性结果。
第三种对照品是基于质粒的回收对照品（RecoveryControl，也被称为外源性内部对照品）；对于各个待测样本，在分离DNA之前将回收对照品加入每一份样本，在核酸抽提完成后，在另 一个PCR反应管中，用另外一套引物和探针（特异性针对回收对照品）进行同步扩增。
RC的作用是证实整个工作流程具有有效性和完整性，包括从DNA分离到PCR的各个环节。
由于RC为加入样本的外源性对照品，所以MycoTOOLqPCR不仅适用于特定的细胞系如CHO，也适用于生物药品生产常用的各种细胞系。
技术报告|15 支原体检测方法概述 对于一个样本的检测，所有扩增反应都要进行重复管扩增（分别采用2份阴性对照品和阳性对照品，4份RC-样本复管检测）。
图9显示的是96孔qPCR反应板的典型布板方案。
123456789101112 ABCDEFGH 支原体预混液：含支原体特异性引物和探针的PCR反应液 回收对照品预混液：含RC质粒特异性引物和探针的PCR反应液 样本 阴性质控品 阳性质控品 图9：MycoTOOLqPCR检测布板方案。
在用MagNAPure24/96仪器进行DNA纯化之前，或在手动提取核酸前，在样本中添加规定浓度的RC质粒。
根据采用的是自动化或手动的核酸纯化方案的不同，1ml样本中抽提纯化获得的DNA最终回收在200μl或400μl洗脱液中。
对样本的支原体检测需进行4管重复，每次使用20μl回收的DNA。
这个样本量相当于原样本体积的40%。
来源：Authors,2017.作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议CCBY3.0（/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
对于一个样品中是否存在支原体污染，可靠的结果判断必须满足以下质控检测标准：所有阴性对照品的结果均为阴性，阳性对照品以及样本的所有RC反应得到的结果均为阳性。
16|技术报告 监管概述 监管概述 由于支原体污染会对细胞培养产生明显的影响，所以监管部门越来越重视支原体的检测。
如今，全世界几乎所有国家都通过立法对生物制药生产的支原体检测进行管理。
监管部门还通过国家药典中关于支原体检测内容的规定赋予其法律约束力。
这些文件对支原体检测方法以及需要监测的产品进行了相关规定。
但是，不同国家推荐的支原体检测方法以及详细的检测方案各不相同。
总的来说，各国对基于NAT的检测法的使用规定存在较大的区别。
培养法和指示细胞培养法等传统的药典方法（见2.2章）被视为经过长期考验的黄金标准，受到所有药典的一致推荐。
虽然不同国家的药典在具体的方法步骤上存在微小差异，但各个国家推荐的基于培养的检测法都具有大体相似的方案。
表3列举了部分国家的监管机构，以及包含有关支原体检测的监管指南的药典。
监管审批系统卫生部负责对药企开发的医药产品进行科学评估、监督和安全监测。
监管审批部门确保市场上的所有药品都具有安全性和有效性，且质量合格。
人用和动物用药品的审批和上市许可都要求药企必须满足官方规定的质量标准，并通过不同的监管机构和委员会加以控制。
药企必须满足的标准由药典规定和发布。
药典列出了药企必须对药品、中间产物以及原料开展的所有检测，对单个国家或联盟的各个成员国都具有法律约束力。
卫生监管单位 欧洲26 欧洲药品管理局（EMA） UK 药物和保健产品监管机构（MHRA） USA 食品药品管理局（FDA） 日本 日本卫生劳动和福利部 （MHLW） 中国 卫生部（MOH） 巴西 巴西卫生部 阿根廷 阿根廷卫生部 药品审批管理机构 人用药品委员会（CHMP） 由MHRA进行国家审批 由EMA进行集中审批 食品药品管理局（FDA） 药品与医疗器械管理署（PMDA） 中国国家食品药品监督管理局 （CFDA） 国家卫生监督局（ANVISA） 药品管理局（ANMAT） 出版药典 欧洲药品质量管理局（EDQM） 英国药典委员会 美国药典委员会 药品与医疗器械管理署（PMDA） 中国药典委员会（ChPC） 国家卫生监督局（ANVISA） 药品管理局（ANMAT） 药典 欧洲药典（EP）27 英国药典28 美国药典（USP）29 日本药典（JP）30 中国药典（ChP）31 巴西药典32 阿根廷药典33 支原体检测的 NAT认可 ✓ ✓ ✓ ✓ 不明确 没有描述 没有描述 NAT验证要求的✓ ✓ (✓)* ✓** 不明确 ✗ ✗ 相关标准 表3：欧盟、美国、日本、中国、巴西和阿根廷的卫生监管部门概述，包括相应的监管机构、具有法律约束力的文件（药典）、对NAT用于常规支原体检测的接受程度以及NAT验证的质量标准要求。
*USP的表述是“通过程序证实具有可比性”**与EP2.6.7.的内容相同。
技术报告|17 监管概述 快速支原体检测的情况则非常不一样，例如NAT。
虽然很多国家的药典都将NAT描述为一种有效的支原体检测方法，但各国为这种方法制定的方案或验证要求却极少具有一致性。
EP和JP等药典详细描述了有关这种方法的验证指南，但其他国家仅仅只是指出NAT是一种经过验证的有效检测方法。
不过，所有国家都要求对这种检测法进行适当的验证，并与常规支原体检测法进行比较。
与其他所有药典相比，EP2.6.7.章描述的NAT验证指南最为详细。
基于NAT的支原体检测法必须满足四个方面的要求：检测限、特异性、稳健性和可比性（表4）。
为了对NAT方法进行全面的通用验证，建议还要加入精密性和交叉污染等额外的验证参数。
验证要求检测限（LOD） 特异性 稳健性可比性 EP2.6.7.检测限的界定要求必须针对每种支原体确定阳性检测临界值（EP2.6.7.章提供了用作检测的建议支原体种类）。
每种支原体必须至少进行三次独立的10倍梯度稀释液进行检测，且每次检测中每种稀释液浓度都必须制备平行管进行检测，以使各稀释液浓度的检测结果总共能达到24个。
阳性临界值指的是至少能够使95%的试验运行检测得到阳性结果的支原体浓度，即至少要取得23个有效的阳性检测结果。
NAT检测的挑战是要使用对多种支原体都具有适用性和特异性的PCR引物。
往往覆盖的检测种类越多，PCR引物也越可能检测到其他种类的细菌。
例如，革兰氏阳性菌与支原体具有密切的系统进化相关性，PCR可能会检测到这种细菌属，从而产生交叉检测的情况（EP2.6.7.章列举了一系列需要检测交叉反应性的细菌属）。
需要证实NAT检测法是否能够在方法参数发生人为导致的微小变化，或检测方法有所变化时不受影响。
EP2.6.7.章列举了一些变化示例和需要检测的试验方案。
可比性的评估应包含NAT检测法与药典检测法的LOD对比。
本章规定了以下验收标准：1)以NAT法代替培养法：需要证实检测限至少达到≤10CFU/ml。
2)用NAT法代替指示细胞培养法：对每种被测支原体的检测限都必须至少达到≤100CFU/ml。
3)在这两种情况下，采用NAT法的检测和采用常规方法的检测必须同时进行，以便用相同样本（CFU可比性）对它们的LOD进行同步评估。
表4：EP2.6.7对验证要求进行了详细总结。
如需了解更多详细信息，请直接查看EP的NAT支原体检测法验证指南。
还有一些不具备法律约束力的文件也可以为NAT支原体检测法的实施提供参考： (i)美国注射剂协会（PDA）在2010年发表了一篇名为“其他支原体检测方法”的技术报告。
它为快速支原体检测法的新用户提供指导，并描述了非传统培养法的支原体检测法的分析流程、分析验证以及可能用途34。
(ii)罗氏制药用MycoTOOLqPCR检测方案对产品进行放行检测。
该分析的验证按照EP2.6.7章的内容实施，可以在保密协议的规定范围内按要求提供通用验证报告。
研究设计和结果的相关摘要见/MycoTOOLqPCR。
(iii)除了USP以外，FDA相关部门还发布了针对特定主题的指南。
FDA的CBER于1993年发布了一则名为“对生产生物制品使用的细胞系进行特征鉴定时需要考虑的几个问题”（PTC）的指南，又在2010年发布了“行业指南”，为支原体的检测提供了更多信息，但它们均不具备法律约束力35,36。
(iv)《生物分析方法验证》也是FDA发布的一则没有法律约束力的文件，文件内容对其他支原体检测方法的验证进行了最佳实践概述。
37 18|技术报告 验证与实施 罗氏MycoTOOLqPCR检测方案逐步验证和实施 对于MycoTOOLqPCR检测方案在针对特定产品的支原体快速检测和放行中的应用，本章内容对验证和实施这种方法的各个步骤以及需要考虑的时间进度问题进行了概述。
支原体的检测一般包含五个步骤：供应商尽职调查、可行性研究、开发验证方法、开展验证研究以及递交报告。
MycoTOOLqPCR方法对支原体检测的通用性参数已经由罗氏制药进行验证，实施验证期间罗氏可以在签订保密协议的前提下按需提供验证报告，以便节省验证时间和成本。
图13展示的是整个工作流程，下文将对其进行详细叙述。
快速支原体检测法的实施 供应商尽职调查 可行性研究 是否需要使用Roche的验证 报告？ 可行性研究 时间较短时间较长 验证策略 验证策略 验证研究 验证 提交 研究 提交 常规检测 *可以将这种服务外包给CRO，例如图10：MycoTOOLqPCR的实施流程图。
流程图的左侧显示的是利用Roche提供的通用验证报告（对CHO生产流程的验证）实施验证。
将MycoTOOLqPCR用于非CHO流程，或者更改Roche通用验证中使用的方法时，需要重新验证MycoTOOLqPCR方法。
流程图的右侧显示的就是这个流程，这个流程需要的时间比较长。
无论是验证还是常规检测，合约研究机构都可以帮助完成这些检测，如MycoplasmaBiosafety，可以将这个流程中的大多数步骤外包给他们。
来源：Authors，2017。
技术报告|19 验证与实施 供应商尽职调查 这个步骤可能需要花费数日至数月的时间。
涉及对市售的支原体检测试剂盒或对合作开展研究的CRO进行尽职调查。
过程中需要参照监管要求考察商业化检测产品的性能参数和质量标准，并评估支原体检测试剂盒供应商以及CRO的实力。
验证开始之前需要先搞清楚如下这些问题：·供应商有没有为仪器和试剂的设计及生产提供适当的相关 文件？·供应商有没有建立适当的变更控制系统？·供应商能不能按要求提供质量和供应协议？·供应商的交付是否及时可靠？·有没有早期验证研究可供参考？·供应商和CRO是否可以回应审核问卷？是否允许在它们的 检测机构里进行实际审核？·供应商是否为最终用户提供培训计划、现场技术服务、安 装和运行验证服务、预防性维护服务以及技术支持热线？·对于针对特定产品的NAT验证研究以及采用NAT方法的 常规检测，CRO是否有足够的经验可以保证相关工作顺利完成？·CRO是否提供验证报告、详细的检测方案或类似文档？·CRO是否提供技术移交解决方案？ 罗氏制药的通用验证报告罗氏制药按照EP2.6.7.的内容（NAT验证指南）对MycoTOOLqPCR进行了全面的通用验证，验证使用的是特定的仪器（LightCycler®480InstrumentII以及MagNAPure96，见图10），适用于使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的相关流程。
一般来说，只要主要流程（包括仪器）不发生变化，FDA或EMA等监管部门就不会要求用户对MycoTOOLqPCR进行全面的再次验证。
因此，如果采用一致的工作流程开展针对特定产品的验证研究，则验证项目中需要使用的样本较少，时间较短。
不过，作出决定之前必须先与监管部门讨论相关的情况。
根据要求，可签订保密协议，并提供本验证报告。
如需查看包含数据总结的简要报告，请访问以下链接。
(/MycoToolqPCR) 在这个过程中可能还需要进行经济评估或财务评估，以便申请内部预算（例如提供合理的项目计划书）。
由此，必须与合约服务提供商明确一次性费用（实验室场地费用、仪器费用、安装费用等）和运营费用（维护、每份样本的检测费用等）等相关费用的问题。
20|技术报告 验证与实施 可行性研究 这个步骤需要的时间从一周到几个月不等。
开展初期的可行性研究时可以租用仪器设备，或者将研究工作托付给CRO。
可行性研究的作用是在购买仪器以及投入资金开展验证研究之前对相关的概念和检测方案进行技术验证，比如考察MycoTOOLqPCR与待测产品材料之间是否存在任何技术层面的不相容性。
MycoTOOLqPCR的验证是用密度为5x106个细胞/ml的CHO细胞实施的，如果采用其他细胞系或者其他浓度水平，则必须通过检测来确定是否存在产物基质效应（例如，PCR抑制）。
可行性研究的另一个目标是评估LOD是否能达到要求的水平，以及需要对MycoTOOLqPCR检测方案做出怎样的调整才能使LOD达到目标水平。
调整方法可能包括增加PCR反应体积或增加PCR循环次数等。
验证策略 这个步骤需要的时间从一两周到几个月不等。
验证策略的作用是为MycoTOOLqPCR验证研究需要实施的所有试验提供路线图（例如，LOD测试、稳健性测试、特异性分析）。
策略的内容包括时间表、试验计划、试验实施方以及相关的验收标准。
如果采用与Roche的通用验证报告一致的实验流程，则可以将通用验证报告作为验证研究的基础，大大减少需要检测的样本数量，降低研究总体费用。
一般来说，在通用验证报告的基础上，仅需对少数标准进行考察和确认（例如，对指定种类的支原体参考株的LOD）。
但总的来看有一点很重要的是，保持与相关的监管部门的沟通和讨论，确认Roche通用验证报告在整个验证流程中可提供的简化验证的作用。
验证研究 这个步骤需要的时间为两个月到几个月。
验证研究的作用是证明MycoTOOLqPCR能够始终按照监管要求有效地进行支原体检测。
这项研究既可以在内部实验室开展，也可以外包给CRO公司。
CRO会按照验证策略的内容进行试验，并将相关的证据记录在验证报告中。
报告递交与常规检测一旦验证报告递交成功并且通过了监管部门的审批，就可以开展常规检测。
根据客户与项目的具体情况，常规检测既可以交给内部质控专家实施，也可以交给CRO公司开展。
技术报告|21 总结与概述总结与概述 基于NAT的自动化快速支原体检测法为生物医药企业提供了革命性的机遇和竞争优势。
无论是样本制备和支原体检测试剂盒的最新进展，还是以满足监管要求为目标，在针对特定产品的验证方面取得的最新进步，都必然会推动这些新的检测系统逐步取代药典培养法，成为行业内更理想的选择。
从最近的发展和趋势来看，预计EMA和美国FDA等监管部门会在未来几年之内逐步批准将NAT快速检测法用于生物制药企业的常规支原体检测。
对于将罗氏MycoTOOLqPCR检测方案作为一种基于NAT的快速自动化支原体检测法用于生物制药产品的过程控制和批次放行，本指南对怎样验证和实施这种检测方案进行了特点概述，并提供了具体的建议。
目前，MycoTOOLqPCR的用户都非常认可这种高度自动化的分析方案。
该方案的优势包括操作简单，工作流程短，当天就能给出结果，对样本进行高通量处理，成本效益高，即使在高细胞密度的“最坏情况”下也不会产生基质干扰效应和PCR抑制效应，此外还可以检测不含细胞的样本。
这种自动化支原体检测系统的通用性验证设计和报告，将大大简化各种生物制药产品的产品特异性放行验证方案。
MycoTOOLqPCR可以用作原料检测、过程控制和最终批次放行的早期报警系统，以便可靠地消除生产过程中存在的支原体污染风险，提高生产效率和产品质量。
与药典记载的培养法相比，基于NAT的自动化MycoTOOLqPCR检测法具有明显的优势，而且可以从合约服务实验室的经验丰富的专家处获取针对特定产品的定制验证方案，因此预计这种方法将来会越来越多地被用于常规支原体检测，也将影响到整个生物制药产业的质控和批放行标准，以及未来的行业发展。
22|技术报告 附录 试剂盒MycoTOOLMycoplasmaReal-TimePCRKitMycoTOOLPCRMycoplasmaDetectionKit QCSamplePreparationKit ResidualDNAE.coliKitResidualDNACHOKit 试剂盒MagNAPure96Instrument MagNAPure24Instrument LightCycler®480InstrumentII 参考标准支原体培养基参考标准品 包装大小1个试剂盒(160次PCR反应) 1个试剂盒 物料号06495605001 05184240001 1个试剂盒 08146829001 1个试剂盒(96次反应)1个试剂盒(96次反应) 0772873500107427689001 说明 用于检测细胞培养物样本中是否存的支原体污染。
MycoTOOL实时PCR试剂盒让支原体检测变得快速、简单和可靠。
用于检测细胞培养物样本中是否存的支原体污染。
MycoTOOLPCR试剂盒让支原体检测变得快速、简单和可靠。
该试剂盒的用途是对核酸进行人工提取和纯化，将处理过的核酸与MycoTOOLMycoplasmaReal-TimePCRKit或MycoTOOLPCRMycoplasmaDetectionAmplificationKit配合使用。
这款试剂盒所包含的方案，适用于正常细胞密度与高细胞密度的细胞培养物样本。
另外，它还可以和ResidualDNACHO试剂盒与ResidualDNAE.coli试剂盒配合使用。
用于检测细胞培养物样本中是否含有大肠杆菌产生的残留宿主细菌DNA。
用于检测细胞培养物样本中是否含有CHO细胞产生的残留宿主细胞DNA。
包装大小1台仪器，控制单元和配件 1台仪器，内置控制单元和配件 1台仪器(96反应模块) 物料号06541089001 07290519001 05015278001 说明高通量工作站，适用于核酸的全自动纯化处理，可以处理多达96个样本。
高通量工作站，适用于核酸的全自动纯化处理，可以处理多达24个样本。
速度快，高通量、基于平板的实时PCR扩增和检测仪器。
物料号mbsCRS-EP10* mbsCRS-JP7* 说明 涵盖EP2.6.7.提到的各种支原体株的全套产品：莱氏衣原体(A.laidlawii)PG8T，精氨酸支原体(M.arginini)G230T，发酵支原体(M.fermentans)PG18T，猪鼻支原体(M.hyorhinis)BTS7T，口腔支原体(M.orale)CH19299T，肺炎支原体(M.pneumoniae)FHT，鸡毒支原体(M.gallisepticum)PG31T，关节液支原体(M.synoviae)WVU1853T，柠檬螺原体(S.citri)R8A2T以及猪鼻支原体(M.hyorhinis)DBS1050α-亚型。
涵盖JP第17版提到的7种支原体株的全套产品：莱氏衣原体(A.laidlawii)PG8T，精氨酸支原体(M.arginini)G230T，发酵支原体(M.fermentans)PG18T，猪鼻支原体(M.hyorhinis)BTS7T，口腔支原体(M.orale)CH19299T，肺炎支原体(M.pneumoniae)FHT，以及关节液支原体(M.synoviae)PG20T。
*EMA和FDA批准可用于NAT法验证的低GC/CFU支原体参考标准品。
浓度分为10、100和1000CFU/100μl，有活株原液、热灭活原液或裂解原液可供选择。
技术报告|23 术语表 术语表 缩写ADPANMATANVISAATPCBERCDERCFUCHOChPChPCCqCROCFDACVMDNAdsDNAEDQMELISAEMAEPEUFDAG+CGMP 定义二磷酸腺苷药品管理局（阿根廷）国家卫生监督局（巴西）三磷酸腺苷生物制品评价和研究中心（USFDA）药品评价和研究中心（美国食品药品监督管理局）集落形成单位中国仓鼠卵巢（细胞）中国药典中国药典委员会循环阈值合同研究机构中国（国家）食品药品监督管理局兽医医学中心（美国FDA）脱氧核糖核酸双链DNA欧洲药品质量管理局酶联免疫吸附测定法欧洲药品管理局欧洲药典欧盟美国食品药品管理局鸟嘌呤-胞嘧啶含量良好生产规范 24|技术报告 术语表 缩写HEKICHJPLODMHLWMHRAMOHMycoTOOLqPCRNATPBSPCRPDAPMDAPTCQCqPCRRCRNASCssDNATD-PCRUKUSUSP 定义人胚肾国际协调委员会日本药典检测限日本卫生劳动和福利部药物和保健产品监管机构（UK）中国卫生部MycoTOOL支原体实时荧光定量PCR试剂盒核酸扩增技术磷酸缓冲盐溶液聚合酶链反应注射剂协会药品与医疗器械管理署FDA/CBER指南1993-PointstoConsider质量控制实时定量PCR回收质控DNA核糖核酸小菌落型单链DNA降落PCR(TouchdownPCR)英国美国美国药典 技术报告|25 参考文献 参考文献 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技术报告|27 RegulatoryDisclaimerForfurtherprocessingonly. 仅用于进一步加工处理使用。
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